李承德 ，周樂樂，高鳳磊，黃康法，嚴(yán)常燕，黃曉剛，范玉珊，張發(fā)良，李 莉，鄭熙燦，張守全，衛(wèi)恒習(xí)*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東省農(nóng)業(yè)動(dòng)物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642；2.廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510507；3.佛山市南海種禽有限公司，廣東佛山 528222）

雞的人工授精產(chǎn)生于20 世紀(jì)30 年代，Burrows 等[1]首先建立了雞的按摩法采精技術(shù)并一直沿用至今。1977年，Sexton[2]發(fā)明了一種磷酸鹽稀釋液BPSE（Belsville Poultry Semen Extender），在家禽精液保存中得到廣泛應(yīng)用。未稀釋的家禽精液受精力會(huì)迅速喪失，稀釋后可延長(zhǎng)精液體外保存時(shí)間；雞精液體外保存效果受稀釋液種類、保存溫度等條件影響[3]。Sexton[2]和Lake 等[4]將稀釋后的雞精液保存在2～5℃條件下24 h，輸精后獲得較好的受精率。人工授精技術(shù)有助于提高優(yōu)良種公雞的利用效率和養(yǎng)雞生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益，因此被廣泛應(yīng)用于集約化規(guī)模化種雞場(chǎng)。但在實(shí)際生產(chǎn)中，雞人工授精技術(shù)仍存在諸如勞動(dòng)量大、精液保存時(shí)間短等問題，致使有些雞場(chǎng)仍使用原精輸精，精液利用效率降低，受精率下降、采精勞動(dòng)強(qiáng)度增加[5-6]。

雞精液稀釋與保存是人工授精技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者在稀釋液開發(fā)和精液保存上做了大量工作，但效果仍不理想，保存6 h 后精子活率普遍較低[3]。雞精液密度大、易發(fā)生凝集、體外存活時(shí)間短，只有經(jīng)過稀釋處理才能進(jìn)行有效的保存和運(yùn)輸[7]。精液體外保存效果受到稀釋液成分、滲透壓、pH、精液稀釋比例、保存溫度等多種因素的影響[3]。近年來研究表明，稀釋液中添加適量的褪黑素等抗氧化劑有助于提高豬、羊、雞的精液保存時(shí)間與精子活力[3,8-9]，但對(duì)人工授精效果的影響仍不明確。本研究針對(duì)我國(guó)南方夏季熱應(yīng)激造成種公雞精液品質(zhì)下降的問題，探索不同保存溫度、不同稀釋比例以及添加褪黑素對(duì)雞精液體外保存及人工授精效果的影響，以期建立適宜的精液稀釋與保存技術(shù)，來滿足夏季種雞場(chǎng)人工授精的技術(shù)需求，同時(shí)為我國(guó)南方地區(qū)種雞場(chǎng)人工授精技術(shù)的推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 精液采自33 周齡的黃羽種公雞，并立即將不同公雞的精液混勻、備用。褪黑素購(gòu)自Sigma 公司，用PBS 配成1 mmol/L 濃儲(chǔ)液，-20℃保存?zhèn)溆?。稀釋液Ⅰ參照胡艷娟[10]報(bào)道的配方進(jìn)行配制，4℃保存。稀釋液Ⅱ在稀釋液Ⅰ的基礎(chǔ)上，添加褪黑素0.5 μmol/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)于2019 年7—9 月在廣東某種雞場(chǎng)進(jìn)行，選用同一雞舍的成年黃羽種公雞21 只、黃羽種母雞400 只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)種蛋在公司的孵化場(chǎng)進(jìn)行孵化。首先將采集的公雞精液進(jìn)行不同比例（1:1、1:2、1:3）稀釋，然后分別在4℃和37℃條件下保存不同時(shí)間（0、4、8、24 h）再進(jìn)行精子活力檢測(cè)，同時(shí)以雞場(chǎng)不進(jìn)行稀釋的原精輸精為對(duì)照，對(duì)不同稀釋液（稀釋液Ⅰ、稀釋液Ⅱ）、不同稀釋比例和不同保存時(shí)間的4℃保存精液分別進(jìn)行人工授精和種蛋受精率的檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 精液采集與稀釋 采用背腹按摩法采集公雞精液，室溫混勻；在37℃下進(jìn)行常規(guī)精液品質(zhì)檢查并記錄精子活力。然后按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)將精液平均分裝到6 個(gè)離心管中，分別用稀釋液Ⅰ和稀釋液Ⅱ在37℃等溫條件下分別進(jìn)行1:1、1:2 和1:3 稀釋，輕搖混勻。再將稀釋后的每份精液平均分成2 管，分別置于37℃和4℃條件下保存。

1.3.2 精液保存與活力檢測(cè) 于4℃和37℃條件保存的精液，分別在不同保存時(shí)間（0、4、8、24 h）進(jìn)行精子活力檢查。具體操作是將精液輕輕混勻，取一小部分于1.5 mL 離心管中，置于37℃恒溫加熱板上；將載玻片和蓋玻片放在37℃恒溫板上預(yù)熱5 min，取1 滴精液滴在載玻片，蓋上蓋玻片，立即在顯微鏡下觀察并記錄精子活力。精子活力采用十級(jí)評(píng)分法，觀察視野中直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子的所占的比例。試驗(yàn)重復(fù)5 次以上。

1.3.3 人工輸精與種蛋孵化 以雞場(chǎng)不進(jìn)行稀釋的原精輸精為對(duì)照，對(duì)不同稀釋液（稀釋液Ⅰ、稀釋液Ⅱ）、不同稀釋比例（1:1、1:2 和1:3）和不同保存時(shí)間（0、4、8、24 h）的4℃保存精液分別進(jìn)行人工授精試驗(yàn)。將400只母雞隨機(jī)分為25 組，每組16 只母雞。一組為對(duì)照組，用原精液進(jìn)行輸精；其他24 組為試驗(yàn)組，分別輸入不同處理保存的精液（2 種稀釋液×3 個(gè)稀釋比例×4 個(gè)保存時(shí)間）。母雞的輸精劑量為0.03 mL/只，間隔5 d輸精1 次。在對(duì)母雞進(jìn)行第3 次輸精的次日開始收集種蛋并做好組別標(biāo)記，連續(xù)收集7 d，種蛋臨時(shí)保存在16℃的貯蛋室，待收集完成后一起入孵。入孵之前清洗好試驗(yàn)種蛋并消毒，孵化溫度為37.8℃，相對(duì)濕度為55%。在入孵后第18 天照蛋，第21 天出苗。觀察和記錄每組的未受精蛋數(shù)、死胎蛋數(shù)、出苗數(shù)、健雛數(shù)等指標(biāo)。種蛋受精率=受精蛋數(shù)/入孵種蛋數(shù)×100%，出苗率=出苗數(shù)量/受精蛋數(shù)×100%，健雛率=健雛數(shù)/總出雛數(shù)×100%。試驗(yàn)重復(fù)3 次以上。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 軟件進(jìn)行整理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 23.0 進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稀釋液及保存溫度對(duì)雞精液精子活力影響 由圖1 可知，不同稀釋液對(duì)精子活力沒有影響，不管4℃低溫保存還是37℃常溫保存，稀釋精液的精子活力隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，但4℃保存效果優(yōu)于37℃保存（P＜0.01）。在4℃條件下，稀釋精液保存0、4、8 h 精子的平均活力分別為0.73、0.70 和0.65（P＞0.05），但保存24 h 的精子活力（0.51）顯著或極顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)。

2.2 不同稀釋比例對(duì)雞4℃低溫保存精液精子活力的影響由表1 可知，不同稀釋比例各組的精子活力均隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。在相同稀釋比例下，保存0 h 和4 h的精子活力極顯著高于保存24 h，而保存0、4、8 h 的精子活力差異不顯著。在相同保存時(shí)間下，不同稀釋比例對(duì)4℃低溫保存精液的精子活力均沒有顯著影響，但隨著稀釋比例的增加而呈下降趨勢(shì)。

表1 不同稀釋比例對(duì)雞低溫保存精液精子活力的影響

2.3 不同稀釋液對(duì)雞人工授精的種蛋受精率、出苗率和健雛率的影響 如表2 所示，不同稀釋液對(duì)4℃保存的稀釋精液的人工授精種蛋受精率、出苗率和健雛率均無顯著影響。不同稀釋液保存0、4、8 h 的種蛋受精率、出苗率和健雛率均無顯著差異，但種蛋受精率均高于原精輸精組，表明精液稀釋有助于提高雞人工授精的種蛋受精率；保存24 h 時(shí)，稀釋液Ⅰ組和稀釋液Ⅱ組的種蛋受精率均顯著降低。

在保存0～8 h 時(shí)，2 種稀釋液的出苗率和健雛率沒有顯著變化；但保存24 h 時(shí)，其出苗率和健雛率均顯著性低于其他保存時(shí)間組和原精輸精組。

表2 入孵種蛋數(shù)和不同稀釋液對(duì)種蛋受精率、出苗率及健雛率的影響

2.4 不同稀釋比例對(duì)雞人工授精的種蛋受精率、出苗率和健雛率的影響 如表3 所示，在保存時(shí)間相同的情況下，不同稀釋比例的保存精液，其種蛋受精率存在顯著差異。當(dāng)保存0 h 時(shí)，1:1 和1:2 稀釋組的種蛋受精率顯著高于原精輸精組；當(dāng)保存8 h 時(shí)，1:3 稀釋組的受精率顯著低于1:1 稀釋組；而當(dāng)保存24 h 時(shí)，不同稀釋比例各組的受精率與保存0、4、8 h 組相比均極顯著降低，其中1:3 稀釋組的受精率最低，顯著或極顯著低于其他各組。

不同稀釋比例各組精液在4℃保存0、4、8 h 對(duì)出苗率和健雛率沒有顯著影響；但保存24 h 則會(huì)顯著降低出苗率和健雛率。綜合來看，精液稀釋比例為1:2 時(shí)效果較好，在4℃保存0～8 h 不會(huì)對(duì)人工授精效果產(chǎn)生不良影響，并能擴(kuò)大雞精液的利用效率。

3 討 論

我國(guó)南方夏季炎熱多雨，局部地區(qū)溫度可達(dá)40℃，熱應(yīng)激造成的公雞精液品質(zhì)下降問題普遍存在。精液保存溫度影響精子的代謝速率，隨著精液保存時(shí)間的延長(zhǎng)，精子代謝不僅消耗大量的能量物質(zhì)，而且產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，如乳酸、活性氧（ROS）等，進(jìn)而影響精子活力和受精能力[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)4℃保存24 h 的精液平均精子活力都在0.5 以上，是適宜的雞精液保存溫度。

精子呼吸代謝產(chǎn)生ROS，可以氧化精子質(zhì)膜的不飽和脂肪酸，使精子受精能力下降[13]。褪黑素具有較強(qiáng)的抗氧化作用，可以減少ROS 含量，降低氧化損傷[14]。褪黑素的抗氧化作用與其添加濃度有關(guān)，在絨山羊精液冷凍稀釋液中添加0.5 mg/mL褪黑素能夠顯著提高絨山羊精子抗氧化能力和冷凍保存效果[15]。在豬精液中添加0.1 μmol/L褪黑素可以顯著提高精液體外保存質(zhì)量和受精能力[16]。李潔等[7]報(bào)道，低濃度褪黑素（1.0 μmol/L）有助于延長(zhǎng)雞精液低溫保存的存活時(shí)間，但高濃度褪黑素（3.0 μmol/L）則不利于精子存活。本研究發(fā)現(xiàn)，在精液中添加0.5 μmol/L褪黑素對(duì)雞精液體外保存以及人工授精效果均沒有顯著影響，可能是添加量不足所致。

雞精液精子密度高，對(duì)精液進(jìn)行適當(dāng)稀釋可增加精液量，充分發(fā)揮優(yōu)質(zhì)種公雞的繁殖性能，降低公雞飼養(yǎng)量，符合種雞場(chǎng)提高生產(chǎn)水平的需求。若采用原精輸精，則公雞母雞比例為1:30；若將原精液稀釋后進(jìn)行人工輸精，則公雞母雞的比例為1:60～1:90[17]。由于雞的輸精量較少，通常為0.03 mL，因此精液稀釋比例不宜過大。潘越博等[18]對(duì)雞精液進(jìn)行1:1、1:1.5、1:2 稀釋，發(fā)現(xiàn)3 組間受精率沒有顯著差異，但精液稀釋后受精率顯著高于原精液。本研究也發(fā)現(xiàn)，稀釋精液人工授精的受精率顯著高于原精授精組。但稀釋精液的體外保存和人工授精效果受到保存時(shí)間的影響，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。在相同保存時(shí)間下，精子活力和受精率隨稀釋比例增加而呈下降趨勢(shì)，但稀釋比例對(duì)出苗率和健雛率沒有顯著影響。在保存8 h 和24 h，1:3 稀釋保存組的受精率顯著降低，這可能是輸精的有效精子數(shù)量降低所致。總體來看，1:2 稀釋組的效果較好，更適合雞場(chǎng)實(shí)際生產(chǎn)。

表3 入孵種蛋數(shù)和不同稀釋比例對(duì)種蛋受精率、出苗率及健雛率的影響

延長(zhǎng)精液保存時(shí)間是種雞場(chǎng)人工授精的迫切需求，除了優(yōu)化保存條件外，還可以不斷優(yōu)化精液稀釋液配方來實(shí)現(xiàn)延長(zhǎng)精液保存時(shí)間。秦國(guó)棟等[19]用生理鹽水對(duì)精液進(jìn)行稀釋，發(fā)現(xiàn)精液最長(zhǎng)保存時(shí)間為2 h。Sexton[2]研究發(fā)現(xiàn)，保存 0、4、24 h，保存5℃條件下并暴露于可見光的雞精液稀釋液與對(duì)照組的受精率相同，而精清的有無、貯存容器中精液與空氣比率對(duì)精子活力無顯著影響。本實(shí)驗(yàn)在種雞場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行，一般是早上在喂食前采精，以防精液混有糞便，若要研究保存10 h 后的人工授精效果，則需要在晚上輸精，不符合實(shí)際生產(chǎn)方面的需求，因此本研究只設(shè)置0、4、8、24 h 共4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)。本研究所采用的稀釋液可以在4℃保存24 h 而維持精子活力在0.5 以上，但其精子活力、受精率、出苗率和健雛率均顯著降低，因此在稀釋配方優(yōu)化及長(zhǎng)效保存方面仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，我國(guó)南方地區(qū)夏季雞稀釋精液4℃保存優(yōu)于37℃保存；4℃保存0～8 h 對(duì)精子活力、種蛋受精率、出苗率和健雛率沒有顯著影響；稀釋液中添加0.5 μmol/L 褪黑素對(duì)精子活力、種蛋受精率、出苗率和健雛率均無影響。綜合來看，以1:2 比例進(jìn)行精液稀釋4℃保存可獲得較好的精液保存和人工授精效果。