職瑾 段斌 吳松笛 王清

甲醛是一種化學分子結構最簡單的醛，由于其具有活躍的化學反應性，甲醛常被用于食品包裝材料、建筑材料和各類裝飾材料 （油漆、涂料、壁紙等）的制造[1-3]。由此可見甲醛從衣食住行各個方面暴露于人類的生產(chǎn)生活中，人類群體中各個年齡段都遭受甲醛毒性的危害[4]。近年來，環(huán)境中甲醛的暴露對人類神經(jīng)行為的影響受到廣泛關注，也注意到內(nèi)源性甲醛的升高與神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默癥密切相關[5]。本研究將以HT22 細胞為神經(jīng)細胞模型，從凋亡和脂質(zhì)氧化物水平這2 個方面探討甲醛誘導的神經(jīng)毒性。但目前對于甲醛誘導神經(jīng)毒性的具體機制報道較少。生長分化因子11 （growth differentiation factor-11，GDF11），來源于轉化生長因子 β （transforming growth factor，TGF-β）超家族，被稱為 “返老還童蛋白”[6]。GDF11 廣泛表達于多種組織器官中，并通過調(diào)控細胞增殖、凋亡等參與機體胚胎發(fā)育，肌肉功能[7]。GDF11 是否影響甲醛誘導的神經(jīng)毒性，本文將做進一步的探討。

材料與方法

一、試劑和儀器

HT22 細胞來源于鼠類海馬細胞系 （遼寧清晨生物科技有限公司）；GDF11 基因片段的真核表達重組質(zhì)粒pcDNAs/GDF11 （廣州卡芬生物科技有限公司）；胎牛血清 （廣州達源生物公司）；DMEM （廣州特普生物公司）；凍存液（山東佰業(yè)生物科技公司）；DCFDA 細胞活性氧 （reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒 （山東龍力生物科技有限公司）；Bax 抗體，Bcl-2 抗體 （廣州賽誠生物公司）；GDF11 抗體（南京諾爾曼科技有限公司）；caspase3 活性檢測試劑盒 （上海碧云天生物技術研究所）；Cytoflex 流式細胞儀（美國Beckm Coulter 公司）。

二、方法

（一）HT22 細胞培養(yǎng)和轉染

1.HT22 細胞培養(yǎng)：當HT22 細胞生長鋪滿瓶壁90 %左右時，進行細胞傳代。棄掉細胞培養(yǎng)液，然后使用tip 頭吸取1 mL 含0.25 %的胰蛋白酶進行消化，在倒置顯微鏡下觀察HT22 細胞軸突回縮時，立即將細胞轉移至培養(yǎng)箱中，迅速加入新鮮培養(yǎng)液終止消化，用長tip 頭將HT22 細胞從瓶壁上吹打下來（吹打次數(shù)一般約為60 次）。制成單細胞懸液后，將細胞懸液分至3 瓶培養(yǎng)瓶中進行接種培養(yǎng)。

2.HT22 細胞轉染：HT22 細胞轉染操作嚴格依照Lipofectamine 2000 轉染試劑說明書用pcDNAs/GDF11 轉染HT22 細胞，構建穩(wěn)定表達GDF11 基因的HT22 細胞（GDF11 組）。GDF11 基因細胞穩(wěn)定表達后，用蛋白免疫印跡法檢測HT22 細胞株中GDF11 蛋白的表達量，以驗證GDF11 轉染HT22 細胞的效果。

（二）細胞計數(shù)試劑盒 （cell counting kit-8，CCK- 8）法檢測HT22 細胞活力

把HT22 細胞分為對照組 （細胞未做任何處理）、甲醛組 （50、100、200 μmol/L 甲醛處理細胞）和GDF11+甲醛組（GDF11 轉染細胞后用100 μmol/ L甲醛處理）。100 μmol/L 處理海馬細胞，細胞活力值為56.24±0.62，選擇此濃度為最適宜濃度，并進行后續(xù)實驗。CCK-8 試劑盒用來檢測細胞的活力。待HT22 細胞處于對數(shù)生長期時，用tip 頭吸取1 mL 胰酶消化，吹打管將HT22 細胞吹打成單細胞懸液，然后將單細胞懸液以每孔100 μL，密度為0.5×104個/mL 均勻接種在96 孔板中。每個組別設置2 個平行對照，將種好細胞的96 孔板平放于37 ℃，5 % CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待孔底均勻鋪HT22 細胞均為60 %時，根據(jù)實驗方案要求給予HT22 細胞相應方式處理，再次放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后，棄掉96 孔板中的培養(yǎng)液，使用預冷PBS洗滌板底2 次，輕輕用吸水濾紙吸出板底殘余的液體。避光環(huán)境中，每孔快速各加入10 μL CCK-8試劑，將96 孔板放于培養(yǎng)箱中4 h 后，立即使用酶標儀以450 nm 的波長，檢測每孔的OD 值。

HT22 細胞活力= （甲醛組或GDF11+甲醛組OD 均值/對照組OD 均值）×100%

（三）HT22 細胞蛋白的提取過程

提前溶解RIPA 裂解液，待其充分溶解后，取適量RIPA 裂解液和苯甲基磺酰氟混合均勻置于冰上備用。取出培養(yǎng)箱中的細胞，棄掉培養(yǎng)液。然后每瓶HT22 細胞加2 ～ 3 mL 預冷的PBS，輕輕搖動60 s 洗滌HT22 細胞瓶壁后，棄去洗滌液。重復以上操作2 次。將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液 （或將瓶直立放置一會兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。待培養(yǎng)瓶內(nèi)無殘余液體時，加入適量配好的裂解液把培養(yǎng)瓶置于冰上。每瓶HT22 細胞加100 μL 的裂解液，均勻鋪滿細胞側，于冰上靜置裂解30 min。然后用刮勺將貼壁HT22 細胞輕柔刮下。將刮下的細胞碎片混合物移至1.5 mL 離心管中。4 ℃下以10 000×g離心10 min 后取上清。最后用BCA 蛋白定量試劑盒定量后，分裝出每次蛋白的用量，放于-80℃保存，盡量保證在1 個月內(nèi)使用完，避免蛋白反復凍融。

（四）蛋白免疫印跡法檢測Bax、Bcl-2 蛋白表達水平

收集樣本并使用BCA 蛋白質(zhì)定量法評估總數(shù)蛋白質(zhì)濃度。然后將定量的蛋白質(zhì)用PBS 稀釋同樣倍數(shù)。每個樣品的蛋白質(zhì)提取相同的體積然后使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用濕式傳遞系統(tǒng)將蛋白質(zhì)轉移到PVDF 薄膜上，在室溫下，使用5%脫脂牛奶封閉2 h 后，膜分別與對應的一抗Bax （1:1 000），Bcl-2 （1:1 000），4 ℃孵育過夜。第2天，用TBST 清洗膜，每次10 min，洗3 次，用二抗稀釋1:5 000 孵育2 h。最后，用同樣的方式使用TBST洗膜（3×10 min），并用熒光增強檢測系統(tǒng)檢測蛋白的表達。

（五）DCFDA 染色流式細胞儀檢測HT22 細胞內(nèi)ROS 水平

待HT22 細胞處于對數(shù)生長期時，以1.5×106個/mL 均勻接種于6 孔板中，放于5 %CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞密度為70 %左右，依照實驗要求給予不同組別相應的處理后，棄上清，用0.25 %的胰酶適度消化后，使用新鮮培養(yǎng)基終止消化，然后用長tip 頭輕輕吹打貼壁細胞，制成細胞懸液，從離心管中移取100 μL 細胞懸液至1.5 mL 的離心管中，再加入20 μmol/L 的DCFDA 溶液，置于37 ℃恒溫箱中繼續(xù)孵育30 min。孵育完成后不需要洗滌細胞，盡快在流式細胞儀上檢測每管的熒光值。

（六）caspase-3 活性檢測試劑盒檢測HT22 細胞中caspase-3 活性水平

取對數(shù)生長期細胞以 （2 ～ 5）×106個/mL 密度均勻接種于96 孔板中，每組設置2 ～ 3 個復孔，待細胞密度為50 %左右，根據(jù)分組進行處理24 h。之后吸取細胞培養(yǎng)液，備用。用胰酶消化貼壁細胞，并收集至備用的細胞培養(yǎng)液中。在4 ℃下，600×g離心5 min 后，收集細胞，小心吸除上清，PBS 洗滌1 次。同前吸盡上清后，加入100 μL 裂解液 （建議加入1 %蛋白酶抑制劑），重懸沉淀，冰上裂解15 min。在4 ℃ 下，16 000×g離心 10 min。之后將上清轉移到預冷的離心管中。嚴格根據(jù)說明書配置反應體系，之后在酶標儀上以A405 波長檢測每孔的OD 值，以此反映caspase-3 活性。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析，GDF11 蛋白、Bax 蛋白、Bcl-2 蛋白、caspase-3 活性、細胞活力的實驗數(shù)據(jù)采用± s表示。兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，甲醛組與對照組比較以及GDF11 +甲醛組與甲醛組比較均采用LSD-t檢驗，以P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、GDF11 轉染后HT22 細胞中GDF11 蛋白的表達

GDF11 轉染后HT22 細胞中GDF11蛋白表達結果顯示，與對照組比較，GDF11 轉染HT22細胞后，GDF11 組蛋白表達水平（130.00±1.21比270.00±2.13）升高，差異具有統(tǒng)計學意義（t=98.987，P＜ 0.001，圖1）。

二、不同濃度甲醛對HT22 細胞活力的影響

不同濃度甲醛干預處理24 h 后HT22 細胞活力結果顯示，與對照組比較，50、100、200 μmol/ L 甲醛處理后細胞活力[（100.00±1.26）%比 （82.15±2.18）%、（56.24±0.62）%、（23.14±0.24）%]均降低，差異具有統(tǒng)計學意義 （LSD-t= 26.402，94.265，359.994，P均 ＜ 0.001，圖2）。

三、GDF11 對甲醛干預的HT22 細胞活力的影響

GDF11 轉染前和GDF11 轉染后，甲醛對HT22 細胞活力的影響結果顯示，與對照組比較，100 μmol/ L 甲醛組HT22 細胞活力下降，差異具有統(tǒng)計學意義（LSD-t= 95.939，P＜ 0.001）。與甲醛組比較，GDF11 +甲醛組HT22 細胞活力升高，差異具有統(tǒng)計學意義（LSD-t= 26.717，P＜ 0.001）。（表1）

圖1 GDF11 轉染后HT22 細胞中GDF11 蛋白表達的情況

圖2 不同濃度甲醛干預對HT22 細胞活力的影響

四、GDF11 轉染對HT22 細胞中凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2 表達的影響

與對照組比較，甲醛組Bax 蛋白表達水平升高、Bcl-2 蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（LSD-t= 195.392，54.384，P均 ＜ 0.001）。GDF11 轉染后有效逆轉甲醛誘導的Bax、Bcl-2 蛋白的表達異常 （LSD-t= 19.359，176.000，P＜ 0.001）。（圖3，表1）

圖3 GDF11 對甲醛干預的HT22 細胞Bax 和Bcl-2 蛋白表達水平的影響

五、GDF11 對甲醛處理的HT22細胞中caspase-3 活性的影響

GDF11轉染前后，HT22細胞中caspase-3活性的結果顯示，甲醛 （100 μmol/L）處理細胞HT22 細胞24 h 后，與對照組比較，HT22 細胞中caspase-3 活性升高。與甲醛組比較，GDF11 +甲醛組HT22 細胞caspase-3 活性降低，差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.001，表1）。

六、GDF11 對甲醛處理的HT22 細胞內(nèi)ROS 水平的影響

GDF11 轉染前后，HT22 細胞中ROS 水平的結果顯示，與對照組比較，甲醛 （100 μmol/L）處理細 胞HT22 細 胞24 h 后，HT22細胞中ROS 水 平（1099.32±75.47 比2802.17±126.49）增加 （LSD-t=153.554，P＜ 0.001）。與甲醛組比較，GDF11 +甲醛組HT22 細胞中ROS 水平 （2802.17±126.49 比1305.36±68.45）水平降低 （LSD-t= 154.187，P＜0.001）。（圖4）

討 論

甲醛是環(huán)境中嚴重的污染物質(zhì)，廣泛存在于人類的日常生活中。長期暴露于甲醛的環(huán)境中，會對人類的皮膚、生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等各個系統(tǒng)造成嚴重損害[4,8-10]。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)對外界刺激極度敏感，暴露于甲醛環(huán)境中會對人類或動物的神經(jīng)功能造成嚴重損害[11]，因此環(huán)境中甲醛污染對人類健康的影響越來越受到關注。同時，人體在代謝過程中也會產(chǎn)生甲醛，但人體本身對甲醛的產(chǎn)生和代謝具有一定的調(diào)控能力[7]。隨著機體衰老，人體對甲醛的調(diào)控能力下降，受到外界刺激時，體內(nèi)甲醛極易異常升高，這被認為是某些神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默癥發(fā)病的誘因，但目前對甲醛誘導神經(jīng)毒性的具體機制仍不明確。GDF11 屬于TGF-β 超家族的成員之一，參與調(diào)控細胞的增殖、分化和凋亡等功能[12]。近年來，發(fā)現(xiàn)GDF11 具有抵抗衰老的作用[13]。有文獻報道，通過連體共生實驗，為年輕小鼠和年老小鼠建立一個共生的血液環(huán)境，4 周后，年老小鼠的認知能力明顯提升，又進一步通過檢測分析發(fā)現(xiàn)年老小鼠腦中神經(jīng)發(fā)生增加，海馬區(qū)神經(jīng)細胞之間聯(lián)系增加，從而提高認知能力[14]。由此分析，認識到GDF11 具有神經(jīng)保護作用，同時也大膽猜想GDF11 是否會對甲醛誘導的細胞凋亡有影響。

表1 GDF11 對甲醛干預的HT22 細胞活力及Bax 和Bcl-2 蛋白表達灰度值的影響 （ ± s）

表1 GDF11 對甲醛干預的HT22 細胞活力及Bax 和Bcl-2 蛋白表達灰度值的影響 （ ± s）

分組 細胞活力值 Bax 蛋白表達灰度值 Bcl-2 蛋白表達灰度值 caspase-3 活性對照組 92.23 ± 0.23 132.19 ± 1.21 220.32 ± 2.21 95.36 ± 1.74甲醛組 56.12 ± 0.61 270.03 ± 0.17 150.25 ± 0.31 190.17 ± 2.14 GDF11 +甲醛組 83.11 ± 1.64 150.17 ± 1.06 187.34 ± 1.52 105.31 ± 4.12 F 值 1018.863 19312.982 3549.137 993.985 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001 ＜ 0.001

圖4 對照組、甲醛組和GDF11 +甲醛組活性氧水平

細胞凋亡是機體本身為維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境，進行自發(fā)性地由基因調(diào)控的死亡程序，讓機體更好地適應生存環(huán)境[15]。caspase-3 是一種蛋白酶，是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶[16]。Bax 是集體中廣泛表達的促細胞凋亡基因之一[16]。Bcl -2 基因編碼的蛋白具有抗凋亡的作用[17]。本研究通過蛋白免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2 蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)GDF11 轉染增強了甲醛對促凋亡蛋白Bax表達的增加作用，并減弱甲醛對抗凋亡蛋白Bcl-2 表達的抑制作用。以上提示GDF11 可抑制甲醛誘導的HT22 細胞凋亡。

ROS 是機體在生命活動中代謝的中間產(chǎn)物，具有高度的化學反應性[16]。人體內(nèi)ROS 過多積累會對機體造成傷害，甚至導致細胞死亡，誘發(fā)各種腫瘤、心血管疾病和神經(jīng)性疾病等多種疾病[16,18]。ROS 過多積累還可使組織器官衰老，誘發(fā)老年性疾病[19]。本研究中，通過DCFDA 染色流式檢測GDF11 轉染對甲醛處理HT22 細胞ROS 水平的影響，發(fā)現(xiàn)GDF11 可降低甲醛處理HT22 細胞的ROS水平，提示GDF11 轉染明顯抑制甲醛對HT22 細胞中ROS 的增加作用。

本研究結果顯示，GDF11 轉染甲醛處理的HT22 細胞后，降低促凋亡蛋白Bax 的表達、增加抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達以及降低甲醛處理的HT22細胞內(nèi)ROS 水平，提示GDF11 可抑制甲醛對HT22細胞的毒性作用，這為如何防治甲醛誘導的神經(jīng)毒性作用提供了一個新的途徑。