薛小軍 李冉冉 洪自強(qiáng) 葉磊 王少怡 孔麗青 周松

放射性腸炎（radiation enteritis，RE）是放射治療和核輻射中常見(jiàn)的一種疾病。小腸黏膜上皮細(xì)胞由于增殖活躍，對(duì)放射線尤為敏感；同時(shí)放射線能損傷位于隱窩內(nèi)的小腸干細(xì)胞 （intestinal stem cell，ISC），表現(xiàn)為ISC 數(shù)量減少和功能減退[1]，導(dǎo)致RE 的發(fā)生快、程度重、修復(fù)困難。有研究顯示，20% ～ 75%接受腹盆腔放療的患者面臨著RE 帶來(lái)的痛苦[2-3]，此外在核泄漏事故、核戰(zhàn)爭(zhēng)和核恐怖襲擊中RE 也是最重要的并發(fā)癥，而對(duì)于RE 目前尚無(wú)公認(rèn)的有效治療方法[4]。間充質(zhì)干細(xì)胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）具有多向分化潛能，在再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用中取得了很好的療效。近年來(lái)，已有MSCs 治療放射性腸炎的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，但其在治療中扮演的角色仍不清晰。本研究采用骨髓MSCs 移植治療放射性腸炎的大鼠模型，觀察小腸黏膜的修復(fù)情況，并探索MSCs 發(fā)揮作用的途徑。

材料與方法

一、材料

20 只清潔級(jí)雄性SD 大 鼠，體質(zhì)量為250 ～300 g [原南京軍區(qū)福州總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 （動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)：SYXK （軍）2017-0042）]；Bmi-1 抗體[上海Abcam 貿(mào)易有限公司 （代理英國(guó)Abcam 公司）]；4，6-二氨基- 2-苯基吲哚 （DAPI）檢測(cè)試劑盒 （瑞士Roche 公司）。

二、方法

1.骨髓MSCs的分離、培養(yǎng)：選用4周齡的大鼠，斷頸處死后，75%乙醇浸泡消毒20 min，在無(wú)菌條件下獲取雙側(cè)脛骨和股骨，剪開骨端，用DMEM/F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，將沖出的骨髓液以117×g離心5 min，棄上清液。沉淀物用10 %胎牛血清的DMEM/F12 重懸后，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。置37 ℃、5 % CO2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞貼壁情況，3 d 后首次換液，以后每2 ～ 3 d換液1 次，7 ～ 10 d 細(xì)胞生長(zhǎng)融合，經(jīng)0.25 %胰酶消化，1 : 2 或1 : 3 傳代，選取生長(zhǎng)良好的P3 代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.骨髓MSCs 的鑒定：選取生長(zhǎng)良好的P3 代細(xì)胞，胰酶消化重懸，PBS 洗滌2 次去除胰酶，分別加入PE 標(biāo)記CD29、CD34、CD45、CD90 單克隆熒光抗體，并設(shè)立同型對(duì)照，室溫避光孵育，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs 的表面標(biāo)志物。

3.RE 動(dòng)物模型的建立：大鼠RE 模型的建立參照徐偉等[5]的研究完成。將大鼠采用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，然后將其固定于解剖板上進(jìn)行輻照。輻照儀采用美國(guó)Rad-Source 公司的低劑量率生物輻照儀。實(shí)時(shí)照射劑量率為：1.5 Gy/min（160 kV，25 mA）；照射范圍：上至劍突，下至恥骨聯(lián)合的5 cm×5 cm 的等效方形照射野。建模是否成功依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)判斷：動(dòng)物煩躁、易激惹、攻擊性強(qiáng)，或精神萎靡，攝食、攝水少，脫毛、腹瀉、便血、體重不增或降低；小腸病理顯示：隱窩細(xì)胞破壞，絨毛高度降低，黏膜萎縮，潰瘍形成，甚至腸瘺形成。在前期實(shí)驗(yàn)中確定了造模良好的穩(wěn)定性，成功率在90 %以上。建模成功后，大鼠隨機(jī)分為骨髓MSCs 治療組和對(duì)照組，每組10 只。每日觀察大鼠的臨床表現(xiàn)。所有實(shí)驗(yàn)均通過(guò)我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

4.骨髓MSCs 移植：于動(dòng)物模型建立后1 周開始進(jìn)行MSCs 移植實(shí)驗(yàn)。移植前1 d，用DAPI 標(biāo)記液標(biāo)記MSCs，以進(jìn)行示蹤分析。移植時(shí)，用0.25 %胰酶、0.1 %EDTA 液常規(guī)消化，獲得細(xì)胞懸液。反復(fù)離心、PBS 重懸洗滌，最后加入LG-DMEM 培養(yǎng)液，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，制成1×106個(gè) /mL 濃度的細(xì)胞懸液，無(wú)菌注射器分裝，1 mL/支，置入冰盒中備用。在MSCs 備用時(shí)，要不斷輕輕搖晃冰盒，防止細(xì)胞聚集和貼壁。MSCs 懸液通過(guò)尾靜脈注射移植到大鼠體內(nèi)。治療組每只大鼠移植1 mL MSCs 懸液（1×106個(gè)/mL）；對(duì)照組大鼠經(jīng)尾靜脈注射1 mL 生理鹽水；每日1 次，連續(xù)3 次。

5.標(biāo)本獲?。阂浦埠? 周處死大鼠，獲取標(biāo)本。采用10 %水合氯醛溶液腹腔注射麻醉。麻醉生效后，無(wú)菌組織剪沿腹中線將腹部剖開，暴露腸組織，截取距回盲部5 cm 的小腸組織。部分作快速冰凍，熒光顯微鏡下觀察DAPI 陽(yáng)性細(xì)胞；部分進(jìn)一步處理，透射電鏡觀察小腸黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；其余小腸以10 %甲醛固定、石蠟包埋，待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)使用。

6.骨髓MSCs 熒光示蹤分析和小腸組織常規(guī)病理檢測(cè)：小腸組織作快速冰凍切片，在熒光顯微鏡藍(lán)色通道下觀察DPAI 陽(yáng)性細(xì)胞。小腸石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察小腸結(jié)構(gòu)。

7.小腸隱窩Bmi-1 陽(yáng)性細(xì)胞的免疫組化染色：（1）空白的組織切片二甲苯脫蠟，檸檬酸鹽抗原修復(fù)液高溫高壓組織抗原修復(fù)，在98℃條件下孵育20 min；（2）將切片置于0.25 % Triton X-100 溶液中孵育10 min，D-Hank's 緩沖液稍沖洗后山羊血清室溫封閉30 min；（3）加入已經(jīng)稀釋的一抗，4 ℃過(guò)夜孵育；（4）Hank's 液洗片，加入HRP 偶聯(lián)的二抗，37 ℃孵育1 h；（5）Hank's 液洗片，加入DAB 顯色液室溫下顯色5 min；（6）流水沖洗，蘇木素染液復(fù)染2 min；（7）返藍(lán)，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

8.小腸組織透射電鏡觀察：（1）取材：小腸切成1 mm×1 mm×2 mm 大小；（2）前固定：3 %戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1 mol/L PBS（pH 7.2） 4 ℃固定2 h 以上，然后漂洗3 次；（3）后固定：1%鋨酸-1.5 %亞鐵氰化鉀4 ℃ 1.5 h，然后漂洗3 次；（4）脫水：50 %酒精10 min，70 %酒精飽和醋酸鈾染液4 ℃過(guò)夜，90 %酒精10 min，90 %酒精-丙酮10 min，90 %丙酮10 min，無(wú)水丙酮10 min×3 次；（5）浸透：無(wú)水丙酮+環(huán)氧樹脂618 包埋劑（1 : 1）1.5 h，純618 包埋劑35 ℃ 3 h；（6）包埋、聚合：35 ℃ 12 h，45 ℃ 12 h，60 ℃ 3 d；（7）切片、染色：超薄切片機(jī)切成70 ～ 80 nm 切片；醋酸鈾、檸檬酸鉛分別染色5 min，蒸餾水水洗；（8）在透射電鏡下觀察并攝片。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)小腸隱窩Bmi-1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行分析。大鼠體重、小腸絨毛高度、隱窩Bmi-1 陽(yáng)性干細(xì)胞數(shù)量以± s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、骨髓MSCs 的分離、鑒定、熒光染色

通過(guò)密度梯度離心的方法，成功分離得到大鼠骨髓MSCs，經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代 （約3 代）之后，細(xì)胞呈現(xiàn)均一的長(zhǎng)梭形，并顯示出良好的貼壁生長(zhǎng)的特性 （圖1a）。經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定表型均一 （圖1c ～ f）：表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記 （CD29+、CD90+），不表達(dá)造血和內(nèi)皮的標(biāo)記 （CD34-、CD45-）。細(xì)胞采用DAPI 染色后呈藍(lán)色（圖 1b）。

圖1 間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定、熒光染色結(jié)果

二、大鼠的一般情況

照射后大鼠出現(xiàn)弓背、脫毛、精神萎靡，進(jìn)食、進(jìn)水減少，腹瀉、便血，體重逐漸降低；移植后1 周，與對(duì)照組相比，治療組大鼠癥狀輕，體重 （190.30 g ±13.23 g 比235.00 g±14.30 g）增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= -7.258，P＜ 0.001）（圖2）。

圖2 治療組與對(duì)照組大鼠體重變化趨勢(shì)

三、骨髓MSCs 的示蹤

小腸組織快速冰凍切片后，熒光顯微鏡下觀察，顯示小腸組織中有藍(lán)色熒光細(xì)胞，即 DAPI 陽(yáng)性細(xì)胞（圖3），證實(shí)MSCs 能夠歸巢至炎癥損傷部位，在組織的損傷修復(fù)中發(fā)揮作用。

圖3 熒光顯微鏡下觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢至小腸（DAPI 染色，×200）

四、 小腸組織結(jié)構(gòu)和絨毛超微結(jié)構(gòu)變化

對(duì)照組小腸絨毛寬大低平，部分上皮潰爛、出血（圖4a），治療組小腸絨毛結(jié)構(gòu)存在，無(wú)明顯潰瘍 （圖4b）。與對(duì)照組相比，治療組大鼠的小腸絨毛高度明顯較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= -15.266，P＜ 0.05；表1）。

電鏡分析：治療組上皮細(xì)胞微絨毛修復(fù)較完整，排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰；對(duì)照組腸上皮細(xì)胞空泡變性，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體輕度腫脹，部分杯狀細(xì)胞排空，間質(zhì)水腫伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn) （圖5）。

五、小腸隱窩Bmi-1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量分析

與對(duì)照組相比，治療組Bmi-1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= -7.612，P＜ 0.05；表1、圖6）。

圖4 光學(xué)顯微鏡下觀察對(duì)照組和治療組小腸組織 （HE染色，×100）

表1 對(duì)照組和治療組大鼠小腸絨毛高度及Bmi-1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)結(jié)果分析 （ ± s）

表1 對(duì)照組和治療組大鼠小腸絨毛高度及Bmi-1 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)結(jié)果分析 （ ± s）

分組 例數(shù) 絨毛高度（μm） Bmi-1 陽(yáng)性細(xì)胞（個(gè)/mm2）對(duì)照組 10 627.50±40.55 60.67±9.63治療組 10 984.33±61.80 87.33±5.47 t 值 -15.266 -7.612 P 值 ＜ 0.001 ＜ 0.001

討 論

圖5 電鏡下觀察對(duì)照組和治療組小腸上皮組織 （×4 000）

RE 是腹盆腔惡性腫瘤患者接受放療后的常見(jiàn)毒性反應(yīng)，其發(fā)病機(jī)制涉及多種細(xì)胞的相互作用、機(jī)體的免疫反應(yīng)、腸道神經(jīng)系統(tǒng)和腸道微生物[6]；由于治療效果欠佳，給患者帶來(lái)極大的創(chuàng)傷。一般認(rèn)為，腸上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、腸壁炎癥反應(yīng)在疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起著重要的作用。急性期表現(xiàn)為腸黏膜炎癥反應(yīng)，慢性期表現(xiàn)為腸缺血、纖維化。

MSCs 是一種多能干細(xì)胞，其來(lái)源廣泛、分離提純方便、易于體外培養(yǎng)，具有低免疫源性和多向分化潛能的特性。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MSCs 可分化為腸上皮細(xì)胞；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，MSCs 可歸巢至受損的腸黏膜。本實(shí)驗(yàn)研究中采用DAPI 標(biāo)記MSCs，移植后在受損腸組織內(nèi)觀察到藍(lán)染的MSCs，顯示出MSCs 歸巢至炎癥組織的特性。MSCs 修復(fù)腸黏膜的機(jī)制包括：（1）直接分化為腸上皮細(xì)胞[7]；（2）分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管的修復(fù)[8]；（3）通過(guò)自分泌、旁分泌的機(jī)制產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用[7-9]。目前，MSCs 在Crohn's 病的臨床治療中顯示出令人滿意的效果，并且安全性也較好[10-11]。

ISC 位于腸黏膜隱窩基底部，是一種具有自我更新能力和高度增殖能力以及多向分化潛能的成體干細(xì)胞，包括2 個(gè)亞群：Lgr-5+亞群和Bmi-1+亞群。ISC 能夠增殖分化為多種細(xì)胞，其中包括上皮細(xì)胞，對(duì)腸道黏膜更新、修復(fù)起著重要的作用，因此如何恢復(fù)照射后腸壁中ISC 的數(shù)量和功能成為治療RE 的關(guān)鍵。馬發(fā)鑫等[12]將炎癥誘導(dǎo)的骨髓MSCs 條件培養(yǎng)基經(jīng)尾靜脈注射到急性輻射誘導(dǎo)的腸損傷模型大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Lgr-5+亞群和Bmi-1+亞群增多，并認(rèn)為Bmi-1+亞群可能通過(guò)分化為L(zhǎng)gr-5+亞群發(fā)揮作用。本研究采用MSCs 經(jīng)尾靜脈移植治療RE 模型的大鼠，發(fā)現(xiàn)其可以歸巢至受損的腸道，修復(fù)受損腸黏膜。在小鼠的RE 模型中，Saha 等[13]也證實(shí)，接受MSCs 移植治療的小鼠腸隱窩內(nèi)Lgr-5+亞群干細(xì)胞表達(dá)數(shù)量增加。MSCs 可以在損傷局部釋放細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子組成ISC 生存的微環(huán)境，并誘導(dǎo)ISC 向絨毛頂端遷移[14]。有研究指出，Wnt /β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路在ISC 的增殖和維持扮演至關(guān)重要的角色[15-16]。Gong 等[17]采用MSCs 治療14 Gy 腹部照射制作的RE 動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)小腸組織中Lgr- 5+亞群的數(shù)量及隱窩的數(shù)量均有增加，另外Wnt3a 和活化β-連環(huán)蛋白表達(dá)量也明顯增加；結(jié)果證實(shí)，MSCs 能夠促進(jìn)內(nèi)源性ISC 的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)小腸黏膜的修復(fù)，其作用的分子機(jī)制與Wnt /β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路的活化增加有關(guān)。另外在炎癥性腸病的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，MSCs 對(duì)腸道微生物的多樣性發(fā)揮促進(jìn)作用[18]，進(jìn)一步促進(jìn)腸黏膜的修復(fù)；MSCs 能通過(guò)抑制Rho/MRTF/SRF 信號(hào)通路抑制腸道纖維化[19]，從而防止纖維組織過(guò)多增生引起腸道狹窄。

本研究中將骨髓MSCs 采用DAPI 標(biāo)記后移植到RE 模型的大鼠體內(nèi)，觀察ISC Bmi-1+亞群的增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bmi-1+亞群數(shù)量增多，受損的腸黏膜得以修復(fù)。本研究推測(cè)MSCs 可能通過(guò)促進(jìn)ISC 的增殖發(fā)揮作用，或者在局部微環(huán)境下MSCs 可轉(zhuǎn)化為ISC，從而進(jìn)一步發(fā)揮修復(fù)作用。