陳浩，吳彬，袁萍，張飛虎，王晚萍，黃志華，黎曉

（1.贛南醫(yī)學院2017級本科生；2.贛南醫(yī)學院2018級本科生；3.贛南醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，江西贛州341000）

缺血器官在恢復血流灌注后加重細胞損傷的現(xiàn)象，稱為缺血再灌注損傷［1］（ischemia reperfusion injury，IRI）。心肌缺血再灌注損傷（Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是當前引發(fā)心血管疾病的主要原因之一［2］。目前溶栓治療仍是臨床上針對心肌梗塞患者采取的最有效的措施之一，但容易誘導心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生［3］，引起各種心血管不良反應甚至心臟驟停［4］。據(jù)文獻報道，現(xiàn)有藥理干預手段多針對心肌缺血再灌注損傷后所誘導的氧化應激機理進行［5-6］，但MIRI機制非常復雜，因而繼續(xù)尋找更多安全有效且多靶點作用機理的藥物意義非凡［7］。淫羊藿素（Icaritin，ICT）是植物雌激素類化合物淫羊藿苷的代謝產(chǎn)物，具有類雌激素樣作用［8］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，ICT對缺血再灌注損傷心肌組織有一定療效，并且發(fā)現(xiàn)ICT濃度為1 mg·kg-1時治療效果最佳，其作用機制可能與抑制氧化應激炎癥級聯(lián)反應有關［9］，但其具體作用靶點仍有待進一步探討。為此，本研究擬探討ICT對缺血再灌注損傷心肌的保護作用是否通過調(diào)控NF-κB信號分子活性，進而抑制炎癥反應的發(fā)生。

1 材料

1.1 實驗動物2個月SD大鼠，雄性，體重220～240 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［動物使用許可證號：SYXK（贛）20180004，動物合格證號：43004700048216，級別：SPF級］，所有使用的動物均于項目申報時經(jīng)贛南醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會審核，符合國家科技部國科發(fā)財字〔2006〕398號文件《關于善待實驗動物的指導性意見》的相關規(guī)定。

1.2 藥物和試劑淫羊藿素（C21H20O6），分子量為368.38，純度≥99%，呈黃色粉末狀，由上海天習化工有限公司提供，用時加二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解（貨號：T887725G，Sigma公司）；P65抗體（貨號：3033S，Cell signaling Technology公司）及其磷酸化抗體（貨號：4764S，Cell signaling Technology公司）；IL-1β（貨號：ab9787，Abcam公司）和IL-6抗體（貨號：ab9324，Abcam公司）；GAPDH抗體（貨號：2118S，Cell signaling Technology公司）；山羊抗兔IgG（貨號：31460）、山羊抗鼠IgG（貨號：31430）等二抗及PVDF膜（貨號：88518）、蛋白定量試劑（貨號：A33972）、增強化學發(fā)光試劑（貨號：34580）等均為Thermo fisher公司產(chǎn)品。反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：C28025，Invitrogen公司）；SYBR?Select Master Mix：Life techno logier（貨號：4472908）；引物由廣州易錦生物技術有限公司合成。

2 方法

2.1 實驗分組與給藥實驗設假手術組、模型組、ICT治療組（1 mg·kg-1），每組8只；ICT治療組按劑量經(jīng)腹腔注射給藥，假手術組和模型組給予同體積的DMSO腹腔注射。由于實驗操作的原因后續(xù)用于實驗的大鼠為假手術組5只、模型組6～7只、ICT治療組6～7只。

2.2 MIRI大鼠模型的制備大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，仰臥固定于鼠板上，術中進行呼吸及心電連續(xù)監(jiān)護。MIRI手術方法：大鼠頸部皮膚常規(guī)消毒清理，用手術刀作皮膚正中切口，鈍性分離皮下各層結締組織，暴露氣管后，行氣管插管術，連接動物呼吸機監(jiān)控呼吸，待正常后（潮氣量4 mL·100 kg-1，呼吸頻率60次/min，呼吸比1.2∶1），沿胸骨左緣約0.5 cm處剪斷第3～4肋骨，打開胸腔，露出心臟，剪開心包；仔細觀察左前降支冠狀動脈（LAD）走行后，用6/0絲線無創(chuàng)縫合針經(jīng)LAD起始部位約2 mm處穿過，并連同栓線共同結扎。觀察心電圖，出現(xiàn)ST段上抬，且結扎部位出現(xiàn)肉眼可見的暗紫色以及心尖部顏色變蒼白，表明缺血成功；缺血45 min后輕輕拔出栓線再復灌60 min，進一步觀察缺血部位，心肌變紅潤、ST段出現(xiàn)回落則表明再灌注成功，結扎失敗或再灌注失敗的大鼠不用于后續(xù)實驗。假手術組僅對其穿針不進行結扎，其他操作與模型組相同，ICT治療組于結扎后即行給藥。

2.3 Real time-PCR方 法 檢 測NF-κB、IL-6和TNF-α的mRNA表達水平再灌注結束后，取大鼠心臟缺血半暗帶區(qū)制備組織勻漿，按照Trizol試劑盒使用說明提取心肌組織的總RNA，之后參照說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。引物序列參見表1。反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性10 s，迅速冷卻至61℃退火20 s，快速升溫至72℃延伸25 s，共40個循環(huán)。

表1引物序列

2.4 Western blot檢測NF-κB（p65）、IL-6和IL-1β的蛋白表達水平心肌組織加入細胞裂解液充分裂解后，4℃離心，12 000 g×5 min，BCA方法進行蛋白定量，取20μg總蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性，經(jīng)SDS/PAGE凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后，一抗4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，增強化學發(fā)光試劑孵育1 min后，化學發(fā)光免疫定量分析系統(tǒng)進行照相及灰度分析。

2.5 統(tǒng)計學方法選用Prism7.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料用-x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 ICT抑制MIRI大鼠炎癥反應的作用根據(jù)前期研究結果，ICT能降低MIRI大鼠心肌組織中IL-1β的mRNA水平（P＜0.05），同時降低血清中IL-1β的含量（P＜0.05）。提示ICT可能可以抑制MIRI誘導的炎癥反應，進一步應用Real time-PCR方法檢測各組大鼠IL-6、TNF-α和IL-1β等炎癥因子的mRNA水平，結果如圖1所示：相比于假手術組，Vehicle組IL-6、TNF-α的mRNA水平明顯升高（其中IL-6 mRNAP＜0.05；TNF-αmRNAP=0.0531，可能受樣本數(shù)量影響），ICT治療后則顯著降低。

進一步應用Western blot方法檢測各組大鼠心肌組織中IL-6、IL-1β的蛋白表達水平加以驗證，結果如圖2所示：相比于假手術組，Vehicle組IL-6、IL-1β的蛋白表達水平明顯升高，ICT治療后可逆轉(zhuǎn)其蛋白表達量，差異有統(tǒng)計學意義，且與mRNA表達趨勢一致，提示ICT的確能有效抑制MIRI所誘導的炎癥反應。

圖1 ICT抑制MIRI大鼠心肌組織中IL-6、TNF-α的mRNA表達水平

3.2 ICT抑制MIRI大鼠炎癥反應的作用路徑NF-κB是細胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與了機體的炎癥反應、免疫應答等過程，是最經(jīng)典的炎癥信號分子［10］。NF-κB家 族 有5個成 員，包 括NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）、RelA（p65）、RelB和c-Rel，通常所說的NF-κB蛋白，是指p65/p50亞單位所形成的二聚體蛋白。因此，我們檢測了各組大鼠心肌組織中NF-κB的mRNA表達水平及p-P65/P65的蛋白表達情況。結果如圖3所示：相比于Sham組，Vehicle組 中NF-κB mRNA表 達 水 平 上 升（P＜0.05）、p-P65/P65蛋白比值升高（P＜0.01）；相比于vehicle組，ICT治療后NF-κB mRNA水平降低（P＜0.05）、p-P65/P65蛋白比值下降（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。

4 討論

圖2 ICT抑制MIRI大鼠心肌組織中IL-6和IL-1β的蛋白表達水平

圖3 ICT抑制MIRI大鼠心肌組織NF-κB表達水平

缺血區(qū)炎癥反應的主要表現(xiàn)是炎性細胞的活化，并釋放IL-1β、TNF-α、IL-6等大量炎性因子［11］。缺血心肌再灌注過程能夠誘導NF-κB的活化，活化的NF-κB可進入細胞核并作用于特定的DNA靶序列，對IL-1、IL-6、TNF-α及IL-8等炎性因子的釋放進行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［12］，因而可促發(fā)炎癥反應并加重心肌組織損傷。說明調(diào)控NF-κB是緩解MIRI大鼠炎癥反應的重要手段［13］，曾先燕，WEI QUAN等也證實了這一點［14-15］。本研究中，我們運用淫羊藿素干預了缺血再灌注損傷大鼠，結果發(fā)現(xiàn)，淫羊藿素能有效抑制MIRI大鼠心肌組織中炎癥因子的表達，并降低NF-κB的mRNA及P65蛋白表達水平，提示淫羊藿素可能通過抑制NF-κB信號分子的活化，進而抑制炎癥因子的釋放，從而減輕MIRI大鼠的心肌損傷。此外，鄭勇等研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷在腸道代謝后的主要產(chǎn)物之一——淫羊藿次苷Ⅱ，能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路抑制脂多糖誘導的星形膠質(zhì)細胞的炎癥反應［16］，而淫羊藿素也是淫羊藿苷的代謝產(chǎn)物之一［17］，進一步提示，NF-κB信號分子可能是淫羊藿素作用的重要靶點。

然而，NF-κB信號的激活形式多樣，主要通過以下三種通路激活：經(jīng)典通路、旁路通路和非典型通路，其中NF-κB1、RelA、c-Rel均由經(jīng)典通路激活，而NF-κB2、RelB由旁路通路激活，對于DNA氧化損傷等所激活的則主要是非典型通路；此外，P65作為NF-κB蛋白的重要組分，其進行翻譯修飾后，也可改變NF-κB的活性［18］，這些證據(jù)表明，NF-κB活性的調(diào)節(jié)機制復雜，其作為淫羊藿素治療和預防MIRI作用中的干預靶點，仍需進一步深入研究。