戚家明，孫杉杉，張東旭，肖建中，徐志文

(1.領先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司，河北 秦皇島 066004； 2.河北省農(nóng)業(yè)生物技術創(chuàng)新中心，河北 秦皇島 066004； 3.河北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳 植物營養(yǎng)與海洋功能肥料重點實驗室，河北 秦皇島 066004； 4.麗水學院 生態(tài)學院，浙江 麗水 323000)

防御假單胞菌(Pseudomonasprotegens)是一種分布廣泛的具有良好生防效果的革蘭氏陰性細菌[1]。Ramette等[1]和Haas等[2]研究發(fā)現(xiàn)，原本屬于熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的CHA0和Pf-5等菌株能夠同時產(chǎn)生藤黃綠菌素(pyoluteorin)和2，4-二乙?；冱S酚(2，4-diacetylphloroglucinol，2,4-DAPG)兩種抗菌物質，相比于其他熒光假單胞菌具有良好的生物防治效果，能夠抑制多種植物病原物生長，故這一類假單胞菌被重新分類為新種防御假單胞菌(Pseudomonasprotegens)。

防御假單胞菌是一類重要的植物根際促生菌，可以分泌多種具有廣譜抗菌能力的活性物質，例如藤黃綠膿菌素(pyoluteorin)、吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，PCA)、吡咯菌素(pyrrolnitrin)、2，4-二乙酰基滕黃酚(2，4-diacetylphloroglucinol，2,4-DAPG)和氰化氫(HCN)等，除抗菌物質外，防御假單胞菌還能分泌一些殺蟲毒素，相比于其他假單胞菌具有更加突出的生物防治效果[2-3]。

利用全基因組序列信息可以對微生物進行準確的分類鑒定和生防潛力的快速挖掘?；诨蚪M水平的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)[4-6]分析和DNA同源性(DNA-DNA hybridization，DDH)[7]分析是常用的微生物分類鑒定方法。antiSMASH在線工具自發(fā)布以來，在挖掘次級代謝產(chǎn)物基因簇領域得到了廣泛的應用，成為了應用最廣泛的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇的挖掘工具[8]。

本試驗對本公司從土壤中分離到的一株具有良好生防效果的生防菌株PF-1進行研究，通過拮抗試驗發(fā)現(xiàn)PF-1對病原真菌的生長具有良好的抑制效果，通過全基因組測序得到PF-1的全基因組信息，結合16S rRNA序列、平均核苷酸一致性(ANI)及DNA同源性(DDH)綜合分析可以對生防菌株PF-1的分類地位進行準確鑒定，利用antiSMASH在線工具對PF-1的抑菌相關功能基因進行分析，探索其生防特性，為菌株PF-1的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：生防菌株PF-1，該菌株為土壤中篩選到具有較好生防效果的根際微生物，由領先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司分離并保存。

植物病原真菌：馬鈴薯枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、棉花黃萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb)，由領先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司分離并保存。

主要培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，蛋白胨10.0 g·L-1、酵母粉5.0 g·L-1、氯化鈉10.0 g·L-1，pH 7；PDA培養(yǎng)基，馬鈴薯200.0 g·L-1、葡萄糖20.0 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 植物病原真菌拮抗試驗

采用平板對峙法，首先在平皿中間分別放置馬鈴薯枯萎病菌(Fusariumoxysporum)和棉花黃萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb)的菌絲塊。然后在菌絲塊兩旁滴加10 μL PF-1的菌液，每種病原菌重復3次拮抗試驗，設不接種PF-1的空白對照，于培養(yǎng)箱中20 ℃培養(yǎng)5 d。根據(jù)下列公式計算PF-1對植物病原菌的生長抑制率：抑制率(%)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)]×100%

1.2.2 生防菌株PF-1的全基因組測序

將PF-1接于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)至對數(shù)期，在4 ℃下4 500 r·min-1離心10 min，舍去上清液收集菌體，利用液氮冷凍保存送至北京諾禾致源科技股份有限公司(Beijing Novogene Bioinformatics Technology Co.， Ltd)進行全基因組測序，獲得其全基因組序列，將PF-1的全基因組信息上傳至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，獲得登錄號為VAVY00000000。

1.2.3 16S rRNA基因序列分析

根據(jù)全基因組注釋信息，選擇16S rRNA基因序列提交至ezbiocloud.net數(shù)據(jù)庫進行比對分析，利用MEGA 7.0.26軟件Neighbor-Joining 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 ANI和DDH分析

使用Jspecies(http://jspecies.ribohost.com/jspeciesws//)中的Mummer[9]對研究中的菌株全基因組進行平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)值的計算。使用Genome-to-Genome Distance Calculation(http://ggdc.dsmz.de/distcalc2.php)[10]對研究中的菌株全基因組進行DDH值的計算。

1.2.5 次級代謝產(chǎn)物合成基因簇分析

本研究利用antiSMASH 3.0[11]bacterial version(https://antismash.secondarymetabolites.org/)對PF-1菌株中次生代謝物合成基因組簇進行預測。

2 結果與分析

2.1 植物病原真菌拮抗試驗

拮抗試驗結果如圖1所示，PF-1對棉花黃萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb.)和馬鈴薯枯萎病菌(Fusariumoxysporum)的生長均具有良好抑制效果，抑菌率分別為71.30%和68.79%。

A， 棉花黃萎病菌，接種PF-1；B，棉花黃萎病菌，不接種PF-1；C，馬鈴薯枯萎病菌，接種PF-1；D， 馬鈴薯枯萎病菌，不接種PF-1。A， Verticillium dahliae Kleb with strain PF-1; B， Verticillium dahliae Kleb without strain PF-1; C， Fusarium oxysporum with strain PF-1; D， Fusarium oxysporum with strain PF-1.圖1 PF-1對棉花黃萎病菌和馬鈴薯枯萎病菌的抑制效果Fig.1 The plate isolate-antagonistic experiments of strain PF-1 with Verticillium dahliae Kleb and Fusarium oxysporum

2.2 菌株PF-1的分子生物學鑒定

2.2.1 基于16S rRNA 序列比對結果的系統(tǒng)進化分析

將全基因組數(shù)據(jù)注釋到的PF-1的16S rRNA序列提交至ezbiocloud.net的數(shù)據(jù)庫中進行比對，利用MEGA7軟件的鄰位連接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹(相似度重復計算1 000次)。生防菌株PF-1基于16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示，PF-1與PseudomonasprotegensPf-5及模式菌株PseudomonasprotegensCHA0聚為一類，可以確定PF-1為防御假單胞菌(Pseudomonasprotegens)。

括號中的序號為相關菌株GenBank的登錄號；分支點上的數(shù)字表示Bootstrap支持率；線段0.0010表示序列差異的分支長度；上標T代表該菌株為模式菌株。下同。The numbers in parentheses represented the sequence accession numbers in GenBank. The numbers in each branch point indicated the rate of support by bootstrap. The scale bar showed the 0.0010 substitution value on each nucleotide site. Superscript T represented the type strain. The same as below.圖2 基于16S rRNA序列比對結果構建的菌株PF-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the strain PF-1 based on 16S rRNA sequence

2.2.2 ANI和DDH分析

選擇在16S rRNA序列比對中的具有全基因組序列數(shù)據(jù)的菌株與PF-1進行ANI及DDH分析。該11株假單胞菌的ANI值和DDH值結果如表1所示，其中PF-1與PseudomonasprotegensPf-5和PseudomonasprotegensCHA0的ANI值分別為99.99%和98.87%，根據(jù)網(wǎng)站給出的95%的種間鑒定標準，菌株PF-1與Pf-5和CHA0為同種，其中PF-1與Pf-5的相似度最高。PF-1與PseudomonasprotegensPf-5和PseudomonasprotegensCHA0的DDH值分別為99.1%和89.6%，根據(jù)網(wǎng)站給出的70%的種間鑒定標準，菌株PF-1與Pf-5和CHA0為同種，其中PF-1與Pf-5的相似度最高，與ANI分析結果一致。

表1 PF-1及其近緣菌種平均核苷酸一致性(ANI)和DNA同源性分析(DDH)數(shù)值Table 1 ANI and DDH analysis between PF1 and relative strains

2.2.3PseudomonasprotegensPF-1次級代謝產(chǎn)物合成基因簇分析

將PseudomonasprotegensPF-1的基因組序列上傳至antiSMASH中進行次級代謝產(chǎn)物合成基因簇挖掘，同時對2.2.2節(jié)中參與分類的假單胞菌株進行次級代謝產(chǎn)物合成基因簇分析，基因簇統(tǒng)計結果如表2所示。P.protegensPF-1具有最多的15個與次級代謝產(chǎn)物合成相關的基因簇。

表2 PF-1及其近緣菌種基因組中次級代謝產(chǎn)物合成基因簇數(shù)量統(tǒng)計Table 2 Statistics of secondary metabolite gene clusters in PF-1 and other Pseudomonas genomes

P.protegensPF-1與親緣關系較近的P.protegensPf-5和P.protegensCHA0具有類似的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇構成。與已知功能的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇比對，P.protegensPF-1中具有5個相似度超過50%的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇，且均具有抗菌作用。

3 討論

植物病害是威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一，目前主要依賴化學農(nóng)藥對植物病害進行防治，然而化學農(nóng)藥的長期大量使用導致農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染問題日益嚴重，同時也使病原菌產(chǎn)生了嚴重的抗藥性。因此，研究其他綠色安全的防治方法已刻不容緩[12-13]。近年來綠色高效的生物防治作為防治植物病害的重要手段逐漸受到研究人員的關注。目前，應用較多的生防細菌主要有假單胞桿菌(Pseudanonas)、芽孢桿菌(Bacillus)、土壤放射桿菌(Agrobacteriumradiobacter)、沙雷氏菌(Serratia)和巴氏桿菌(Pasteurella)等，其中針對假單胞菌和芽孢桿菌的研究最多[14-15]。

PF-1是作者所在研究團隊從植物根際土壤中分離到的一株具有良好應用效果的生防菌株，為明確其分類地位及分析挖掘其生防潛力，本研究對PF-1進行了全基因組測序，結合相關軟件分析確定了PF-1的分類地位并對其抗病防病能力進行了分析。

16S rRNA基因是細菌系統(tǒng)發(fā)育和種屬鑒定的常用分類工具，但自身也存在一定的局限性，在基因組水平上，DNA同源性分析(DDH)是用于區(qū)分原核生物種屬的重要指標，當DDH值大于70%時可以被認為屬于同一種[16]，平均核苷酸一致性分析(ANI)是對兩個基因組間同源基因的相似性進行分析來評估物種間的親緣關系遠近，ANI值達到95%以上的菌株被認為是同一個種[17]。在本研究中結合PF-1的16S rRNA基因序列、平均核苷酸一致性(ANI)分析及DNA同源性(DDH)分析，可以準確將PF-1鑒定為防御假單胞菌。

antiSMASH是一種能夠較完整的挖掘細菌和真菌基因組中次生代謝產(chǎn)物基因簇的在線工具，在挖掘次級代謝產(chǎn)物合成基因領域得到了廣泛的應用[8]。本研究中將與PF-1親緣關系較近的幾株假單胞菌的基因組提交至antiSMASH進行分析，PF-1具有最多的15種與抑菌物質合成相關的基因簇，其中包括藤黃綠膿菌素、硝吡咯菌素、Orfamide和2，4-二乙?；冱S酚等重要抑菌物質的合成基因簇。

藤黃綠膿菌素(pyoluteorin)是一種芳香族聚酮類抗生素，對多種細菌和真菌的生長具有抑制作用，其對卵菌綱的病原菌的抑制性最強[18-20]，藤黃綠膿菌素可以直接作用于病原菌，或形成一個不利于病原菌的環(huán)境條件從而間接抑制病原菌的生長[21]。有研究表明其對棉花立枯病[22]和由腐霉引起的水芹腐爛病[18]等病害具有較好的防治效果。

硝吡咯菌素(pyrrolnitrin)是色氨酸衍生的有機鹵代次級代謝物[23]，可以影響能量依賴的生理代謝過程，從而抑制DNA、RNA和蛋白質的合成，減少病原微生物對氨基酸、胸腺嘧啶及尿嘧啶的吸收[24]。硝吡咯菌素對多種植物病害具有防治作用，例如由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的病害等，硝吡咯菌素衍生物苯吡咯已經(jīng)被開發(fā)為農(nóng)業(yè)殺菌劑[25，26]。

Orfamide是一種環(huán)脂肽類抗菌物質，其對疫霉屬(Phytophthora)和腐霉屬(Pythium)病原菌的游動孢子具有抑制活性，對立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)具有抑制生長的作用[27-28]，同時Orfamide也具有殺蟲活性[29]。除抑菌活性外，Orfamide還是一種植物系統(tǒng)誘導抗病性(induced systemic resistance，ISR)的激發(fā)子，提高植物自身對病原物的抗性從而減少病害的發(fā)生[30]。

2，4-二乙?；冱S酚(2，4-DAPG)屬于酚類抗生素，具有廣譜的抗真菌、細菌及殺蠕蟲活性，還具有除草活性[31]。其對番茄青枯病[32]、花生莖腐病[33]及許多豌豆病害[34]具有良好的防治效果。2，4-DAPG也是一種植物系統(tǒng)誘導抗病性的激發(fā)子，可以誘導擬南芥對活體營養(yǎng)型卵菌(Hyaloperonosporaarabidopsidis)[35]和丁香假單胞菌番茄專化型(Pseudomonassyringaepv. tomato)[36]的抗性。

防御假單胞菌PF-1具有種類豐富的次生代謝產(chǎn)物基因簇，具有多樣的生防機理。次生代謝產(chǎn)物不僅對多種病原細菌和病原真菌的生長具有直接抑制生長的能力，除此之外部分代謝產(chǎn)物同時還是植物誘導系統(tǒng)抗性(ISR)的激發(fā)子，例如Orfamide和2，4-DAPG。誘導系統(tǒng)抗性是由非病原性細菌分泌的物質引起的植物體內(nèi)系統(tǒng)性抗性從而提高植物整體的抗病能力。除5種已知功能的次生代謝產(chǎn)物基因簇外，防御假單胞菌PF-1還有10種與已知功能的次生代謝產(chǎn)物基因簇相似度較低和5種未知功能的次生代謝產(chǎn)物基因簇，這表明PF-1具有較大的應用潛力有待開發(fā)。

4 結論

本研究對具有良好生防效果的菌株PF-1進行全基因組測序得到了其基因組序列，通過對PF-1的16S rRNA基因、平均核苷酸一致性分析及DNA同源性分析可以準確地將PF-1鑒定為防御假單胞菌。通過antiSMASH在線工具對PF-1中次生代謝產(chǎn)物基因簇進行分析，共發(fā)現(xiàn)15個相關基因簇，次生代謝產(chǎn)物基因簇種類豐富，生防機理多樣，具有較強的抑制病原微生物生長和提高植物自身抗性的功能。本研究通過基因組分析發(fā)現(xiàn)防御假單胞菌PF-1具有較強的應用潛力，為其在防病增產(chǎn)方面的應用提供了理論依據(jù)。