鐘 靜，譚 芬，張洪權(quán)，熊校勤，黃麗霞

(湖北第二師范學(xué)院，植物抗癌活性物質(zhì)提純與應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430205)

植物維管組織包括內(nèi)部的木質(zhì)部、外部的韌皮部和中間的形成層細(xì)胞，它們共同構(gòu)成植物“骨架”[1]。維管組織在植株正常的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[2]，其木質(zhì)部向上運(yùn)輸根吸收的水分和無(wú)機(jī)鹽，韌皮部向下運(yùn)輸有機(jī)物(例如光合作用產(chǎn)生的糖類)，從而將植物地上部分的葉、其他器官與地下部分的根聯(lián)系起來(lái)[3-4]。同時(shí)，維管組織還具有機(jī)械支撐、儲(chǔ)藏和傳遞信息等多種功能[2]。最新研究顯示，植物維管組織發(fā)育過(guò)程受多種內(nèi)外環(huán)境影響、涉及多種信號(hào)機(jī)制[5]。Motose等[6-7]在2001年首次報(bào)道了一類阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan proteins，AGPs)在百日菊(ZinniaelegansL.)葉肉細(xì)胞導(dǎo)管分化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并將其命名為木質(zhì)形成素(xylogen)。隨后的研究顯示，木質(zhì)形成素蛋白骨架同時(shí)包括AGP結(jié)構(gòu)域和非典型脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(non-specific lipid transfer protein，nsLTP)結(jié)構(gòu)域，因此又被稱為木質(zhì)形成素類AGP(Xylogen-like arabinogalactan protein，XYLP)[8]。擬南芥xylp1/xylp2雙突變體葉片中葉脈發(fā)育不連續(xù)或者存在錯(cuò)誤連接，同時(shí)葉脈減少；但是，雙突變體幼苗胚軸中的維管系統(tǒng)并無(wú)顯著變化[9]。對(duì)水稻XYLP7的研究結(jié)果表明，該基因在穗軸生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的快速發(fā)展，人們對(duì)糧食的需求日益增加。玉米是我國(guó)一種重要的糧食作物，其從籽粒到秸稈都具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。前人的研究表明，XYLPs在植物維管組織發(fā)生過(guò)程中起著重要作用，但是對(duì)其研究主要集中在擬南芥、水稻和百日菊中[6-10]。對(duì)玉米等重要的經(jīng)濟(jì)作物中該類蛋白的研究十分有限。同時(shí)XYLPs的功能是否也涉及植物其他生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程也并不清楚?；诖?，本研究對(duì)前期從玉米全基因組中鑒定的16個(gè)XYLPs蛋白骨架結(jié)構(gòu)、基因的染色體定位和復(fù)制情況、表達(dá)模式等進(jìn)行了較為深入的分析。研究結(jié)果能夠?yàn)檫M(jìn)一步解析XYLPs在重要的經(jīng)濟(jì)作物玉米中的生物學(xué)功能提供重要線索。

1 材料與方法

1.1 玉米XYLPs序列獲得

參照前期方法獲得玉米XYLPs基因家族基因和蛋白序列[11]。

1.2 玉米XYLPs基因染色體定位和復(fù)制分析

將蛋白序列提交至maizeGDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.maizegdb.org)中檢索其基因座位，利用MapChart軟件繪制染色體定位圖[12-13]。在數(shù)據(jù)庫(kù)中查找ZmXYLPs基因存在的片段復(fù)制關(guān)系。當(dāng)基因?qū)Φ墓簿€性關(guān)系小于500 kb時(shí)，認(rèn)為基因之間存在片段復(fù)制關(guān)系[8]。當(dāng)基因?qū)ξ挥谕蝗旧w且之間被最多5個(gè)基因所間隔時(shí)，認(rèn)為基因之間存在串聯(lián)復(fù)制關(guān)系[10]。

1.3 玉米XYLPs基因表達(dá)模式分析

從maizeGDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載前人提交的玉米基因芯片(Microarray)表達(dá)數(shù)據(jù)，并從中查找ZmXYLPs的表達(dá)數(shù)據(jù)，其中ZmXYLP2/10/13/16這4個(gè)基因未查找到數(shù)據(jù)。隨后從中選擇以下組織的Microarray數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：萌發(fā)24 h的種子(24 h-germinating seed，24H-GS)、播種后6 d的胚芽鞘(6 days after sowing-coleoptile，6DAS-C)、播種后6 d的初根(6 days after sowing-primary root，6DAS-PR)、出苗期的整個(gè)小苗(vegetative emergence-whole seedling，VE-WS)、一葉/三葉/四葉期的莖和莖頂端分生組織(vegetative 1/3/4-stem and shoot apical meristem，V1-SS)、五葉期的莖尖(V5-shoot tip，V5-ST)、三葉期第一片葉和葉鞘(V3-first leaf and sheath，V3-LS)、三葉期最頂端的葉(V3-topmost leaf，V3-TL)、七葉期處于第二階段葉的頂部(V7-tip of stage-2 leaf，V7-TSL)、七葉期處于第二階段葉的基部(V7-base of stage-2 leaf，V7-BSL)、九葉期幼葉(V9-immature leaves，V9-IL)、九葉期第八片葉(V9-eighth leaf，V9-EL)、抽雄期的第十三片葉(vegetative tasseling-thirteenth leaf，VT-TL)、五葉/七葉期第一節(jié)間(V5/7-first internode，V5-FI)、九葉期第四節(jié)間(V9-fourth internode，V7-FI)、十三葉期幼雄穗(V13-immature tassel，V13-IT)、十八葉期減數(shù)分裂期雄穗(V18-meiotic tassel)、十八葉期的幼雌穗(V18-immature cob，V18-IC)、吐絲期授粉前的雌穗(R1-pre-pollination cob，R1-PC)、吐絲期的花絲(R1-silks，R1-S)、吐絲期的花藥(R1-anthers，R1-A)、授粉后2/6/10天的種子(2/6/10 days after pollination-whole seed，2/6/10DAP-WS)、授粉后12～22 d的胚乳(12-22 days after pollination-endosperm，12-22DAP-En)、授粉后16～22 d的胚胎(16-22 days after pollination-embryo，16-22DAP-Em)[12]。對(duì)查找到的12個(gè)ZmXYLPs表達(dá)數(shù)據(jù)利用Cluster和Treeview軟件做出熱圖，并對(duì)其進(jìn)行聚類分析。

1.4 玉米XYLPs蛋白骨架結(jié)構(gòu)分析

將蛋白序列分別提交至SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1)、SignalP4.1(http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)和Big-PI Plant Predictor(http://mendel.imp.ac.at/gpi/plant_server.html)檢測(cè)nsLTP結(jié)構(gòu)域、N端信號(hào)肽和C端糖基磷脂酰肌醇錨(glycosylphosphatidylinositol，GPI)[14-16]。手動(dòng)檢測(cè)蛋白序列中富含PAST(Hyp/Pro、Ala、Ser和Thr)的AGP結(jié)構(gòu)域[17]。

1.5 玉米XYLPs糖基側(cè)鏈修飾位點(diǎn)分析

將蛋白序列提交到NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)檢測(cè)N連接糖基側(cè)鏈修飾位點(diǎn)。參照前人研究手動(dòng)檢測(cè)蛋白序列中可能的O連接糖基側(cè)鏈修飾位點(diǎn)：蛋白質(zhì)骨架中含有Ala/Ser/Thr-Pro且相鄰脯氨酸之間間隔的氨基酸少于11個(gè)，則結(jié)構(gòu)中的Pro可被阿拉伯糖和半乳糖修飾；在[(Ala/Ser/Thr)-Pro]2-4結(jié)構(gòu)中的Pro可被阿拉伯糖基側(cè)鏈修飾位點(diǎn)[18-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmXYLPs基因的染色體定位及基因復(fù)制

根據(jù)從maizeGDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的ZmXYLPs基因精確座位，將16個(gè)ZmXYLPs基因標(biāo)識(shí)到玉米染色體上。結(jié)果顯示，1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、8號(hào)、9號(hào)和10號(hào)染色體上分別分布有2個(gè)、4個(gè)、1個(gè)、2個(gè)、1個(gè)、4個(gè)和1個(gè)ZmXYLP基因。第3號(hào)、6號(hào)和7號(hào)染色體無(wú)ZmXYLPs的分布(圖1)。進(jìn)一步檢測(cè)了ZmXYLPs的基因復(fù)制情況，結(jié)果顯示，玉米ZmXYLPs基因家族成員中存在4對(duì)片段復(fù)制基因?qū)Γ篫mXYLP6-ZmXYLP8、ZmXYLP8-ZmXYLP7、ZmXYLP7-ZmXYLP9和ZmXYLP9-ZmXYLP10。3對(duì)串聯(lián)復(fù)制基因?qū)Γ篫mXYLP3-ZmXYLP4、ZmXYLP8-ZmXYLP9和ZmXYLP15-ZmXYLP16。

左邊為染色體長(zhǎng)度標(biāo)尺，單位為Mb；頂端為染色體號(hào)，染色體上的黑色橢圓表示著絲粒位置；紅色直線表示基因之間發(fā)生了片段復(fù)制事件，淺灰色背景表示基因之間發(fā)生了串聯(lián)復(fù)制事件。The scale of chromosome length with the unit of Mb was located on the left; the chromosome number was located on the top; the red line indicated that there was a segment replication event between genes， and the light grey background indicated that there was a series replication event between genes.圖1 ZmXYLPs基因的染色體定位和基因復(fù)制關(guān)系Fig.1 Chromosomal localization and gene duplication of ZmXYLP genes

2.2 ZmXYLPs基因表達(dá)模式分析

進(jìn)一步對(duì)ZmXYLPs在37個(gè)玉米不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，ZmXYLPs基因在玉米不同發(fā)育時(shí)期的組織和器官中的表達(dá)存在明顯差異(圖2、圖3)。ZmXYLP1/3/5在所有組織中的表達(dá)量均很低(圖2、圖3)。而ZmXYLP7和ZmXYLP8則特異性的在播種后6 d的初根中表達(dá)，但是ZmXYLP8表達(dá)水平明顯高于ZmXYLP7。ZmXYLP9在幼葉中高量表達(dá)，在七葉期葉的基部和十三葉期的幼雄穗中量表達(dá)(圖2、圖3)。ZmXYLP6/14/15表達(dá)模式較為相似，在大多數(shù)營(yíng)養(yǎng)組織和少部分生殖器官中都有表達(dá)，但是ZmXYLP14的表達(dá)水平普遍明顯低于ZmXYLP6和ZmXYLP615(圖2、圖3)。在三葉期最頂端的葉片、七葉期葉的基部和九葉期的幼葉中ZmXYLP6和ZmXYLP615都呈現(xiàn)高表達(dá)(圖2)。五葉期的莖尖、十三葉期的幼雄穗、十八葉期減數(shù)分裂的雄穗和授粉后2 d的種子中ZmXYLP6表達(dá)水平高于ZmXYLP15(圖2、圖3)。此外，在播種后6 d的胚芽鞘中也檢測(cè)到ZmXYLP15的表達(dá)(圖2)。ZmXYLP4表達(dá)量普遍較低，且主要在生殖器官中低表達(dá)。ZmXYLP12在大多數(shù)組織器官中呈現(xiàn)泛表達(dá)模式，且表達(dá)量均較高(圖2、圖3)。ZmXYLP11的表達(dá)模式與其他蛋白均不相同，僅在生殖器官中表達(dá)，尤其在胚胎中的表達(dá)量較高(圖3)。

頂端數(shù)字為對(duì)應(yīng)的ZmXYLPs；底部色彩刻度標(biāo)尺顯示信號(hào)值的大小，從黑到紅表示信號(hào)值從低到高。下同。The name of ZmXYLPs was located on the top; the bottom color scale corresponded to size of the signal value， from black to red indicated that the signal value was from low to high. The same as below.圖2 ZmXYLPs在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)模式Fig.2 The expression pattern of ZmXYLPs in vegetative growth stage

圖3 ZmXYLPs在生殖生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)模式Fig.3 The expression pattern of ZmXYLPs in reproductive development stage

2.3 ZmXYLPs蛋白結(jié)構(gòu)分析

對(duì)16個(gè)ZmXYLPs的蛋白序列提交到在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，所有蛋白均含有N端信號(hào)肽，信號(hào)肽長(zhǎng)度在21～29個(gè)氨基酸之間，其中ZmXYLP1、ZmXYLP10和ZmXYLP14具有C端的GPI錨(表1)。所有蛋白都具有1個(gè)nsLTP結(jié)構(gòu)域。ZmXYLP1和ZmXYLP14含有2個(gè)AGPs結(jié)構(gòu)域，其余均僅含有1個(gè)AGPs結(jié)構(gòu)域(表1)。

根據(jù)N端信號(hào)肽、GPI錨、nsLTP和AGP結(jié)構(gòu)域位置，可將16個(gè)ZmXYLPs分為兩類(表1、圖4)。第一類中，nsLTP結(jié)構(gòu)域位于中間，左右兩側(cè)分別有2個(gè)AGP結(jié)構(gòu)域，C端有一個(gè)GPI錨。除ZmXYLP1、ZmXYLP10和ZmXYLP14三個(gè)以外，其余ZmXYLPs均屬于第二類，nsLTP結(jié)構(gòu)域位于AGP結(jié)構(gòu)域之后，無(wú)C端GPI錨(圖4)。

綠色方塊代表N端信號(hào)肽，紅色方塊代表AGP結(jié)構(gòu)域，藍(lán)色方塊代表nsLTP結(jié)構(gòu)域，紫色方塊代表C端GPI錨。The green boxes represented the N-terminal signal peptide， the red boxes represented the AGP domain， the blue boxes represented the nsLTP domain and the purple boxes represented the GPI anchor signal.圖4 ZmXYLPs蛋白結(jié)構(gòu)示意圖Fig.4 The sketch map of protein structure of ZmXYLPs

表1 玉米XYLPs蛋白結(jié)構(gòu)分析Table 1 Protein structure analysis of maize XYLPs

2.4 ZmXYLPs蛋白糖基側(cè)鏈修飾位點(diǎn)分析

對(duì)ZmXYLPs蛋白骨架糖基側(cè)鏈修飾位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果顯示，ZmXYLP10、ZmXYLP13和ZmXYLP14各有一個(gè)位于nsLTP或AGPs結(jié)構(gòu)域的N連接糖修飾位點(diǎn)。所有ZmXYLPs均至少有1個(gè)O連接糖修飾位點(diǎn)，但是僅ZmXYLP6、ZmXYLP11、ZmXYL12和ZmXYLP15這4個(gè)蛋白中有(A/S/T)-P3結(jié)構(gòu)(表2)。ZmXYLP11中O連接糖修飾位點(diǎn)多達(dá)19個(gè)，主要包括(A/S/T)-P和(A/S/T)-P2兩種結(jié)構(gòu)(表2)。

表2 玉米XYLPs蛋白糖基修飾位點(diǎn)分析Table 2 Analysis of glycosyl modification sites of maize XYLPs

3 討論

本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)16個(gè)ZmXYLPs基因進(jìn)行了染色體定位、表達(dá)和蛋白結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，玉米第3號(hào)、6號(hào)和7號(hào)這3條染色體上沒(méi)有ZmXYLPs基因的分布，但是2號(hào)和9號(hào)染色體上分別聚集有4個(gè)ZmXYLPs基因(圖1)。這說(shuō)明ZmXYLPs基因家族成員在染色體上的分布具有一定的偏好性。進(jìn)一步的檢測(cè)結(jié)果顯示，ZmXYLPs基因家族中的5個(gè)成員均由片段復(fù)制而來(lái)，且形成4對(duì)片段復(fù)制基因?qū)?；同時(shí)有4個(gè)成員由串聯(lián)復(fù)制而來(lái)，形成2對(duì)串聯(lián)復(fù)制基因?qū)?。其中ZmXYLP15同時(shí)涉及片段復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制事件(圖1)。共有8個(gè)(50%)ZmXYLPs涉及基因復(fù)制，說(shuō)明基因復(fù)制事件在ZmXYLPs家族的擴(kuò)張和進(jìn)化中扮演了極其重要的角色，且片段復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制對(duì)該家族膨脹的貢獻(xiàn)基本相同。

利用基因芯片(microarray)數(shù)據(jù)對(duì)這些基因表達(dá)模式的分析結(jié)果顯示，ZmXYLP1/3/5在幾乎所有組織中均呈現(xiàn)低表達(dá)，暗示著這3個(gè)基因可能存在功能冗余性(圖2、圖3)。ZmXYLP7和ZmXYLP8都特異性地僅在初根中表達(dá)，盡管兩個(gè)基因之間存在片段復(fù)制關(guān)系，但是其各自的表達(dá)量有明顯差異。ZmXYLP7和ZmXYLP9也是片段復(fù)制基因?qū)?，但是ZmXYLP9并未在初根中有表達(dá)且其表達(dá)的部位要多于ZmXYLP7。同樣的情況也出現(xiàn)在ZmXYLP6和ZmXYLP8片段復(fù)制基因?qū)σ约癦mXYLP8和ZmXYLP9串聯(lián)復(fù)制基因?qū)χ?圖2、圖3)。在ZmXYLP9和ZmXYLP15片段復(fù)制基因?qū)χ?，ZmXYLP15的表達(dá)范圍在覆蓋ZmXYLP9的基礎(chǔ)上有較大的擴(kuò)大，且表達(dá)量有明顯提高(圖2、圖3)。以往的研究表明，XYLPs的生物學(xué)功能可能涉及植物維管組織發(fā)生[6-7，9-10]。但是本研究結(jié)果顯示，有7個(gè)ZmXYLPs基因在生殖器官中也呈現(xiàn)高量表達(dá)模式(圖3)。其中ZmXYLP12呈泛表達(dá)模式(除九葉期第八片葉以外)，且表達(dá)量普遍較高。而ZmXYLP11則僅在生殖器官中表達(dá)，尤其在授粉后16～22 d的胚胎中高量表達(dá)(圖3)。此結(jié)果暗示著基因復(fù)制事件不僅擴(kuò)大了該基因家族成員的數(shù)目，同時(shí)還可能導(dǎo)致基因表達(dá)部位的擴(kuò)張，從而產(chǎn)生新的生物學(xué)功能。

進(jìn)一步對(duì)ZmXYLPs蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。與前人研究一致的是，ZmXYLPs蛋白序列較為保守，均含有N端信號(hào)肽和一段nsLTP結(jié)構(gòu)域(表1)。但是16個(gè)ZmXYLPs蛋白中僅有ZmXYLP1/10/14三個(gè)蛋白含有被nsLTP結(jié)構(gòu)域隔開的兩段AGP結(jié)構(gòu)域和C端GPI錨。其余13個(gè)蛋白均只含有一段AGP結(jié)構(gòu)域且無(wú)C端GPI錨，并且nsLTP結(jié)構(gòu)域均位于蛋白C末端(圖4)。而前人報(bào)道的擬南芥13個(gè)AtXYLPs均含有C端GPI錨，21個(gè)水稻OsXYLPs中僅1個(gè)不含有C端GPI錨。同時(shí)在擬南芥和水稻XYLPs中，大多數(shù)蛋白含有兩段AGP結(jié)構(gòu)域[10，22]。這說(shuō)明XYLPs蛋白可能存在一定的種屬特異性。XYLPs是一類嵌合型的AGPs，AGPs是一類富含阿拉伯糖和半乳糖的糖蛋白。因此，本研究對(duì)ZmXYLPs蛋白的糖基側(cè)鏈修飾位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。僅3個(gè)ZmXYLPs蛋白存在N連接的糖修飾位點(diǎn)。其余蛋白糖修飾位點(diǎn)均為O連接，多數(shù)ZmXYLPs蛋白O連接糖修飾位點(diǎn)數(shù)目為1～5個(gè)。此外，O連接糖修飾位點(diǎn)的氨基酸組成也存在差異，具有(A/S/T)-P3結(jié)構(gòu)的ZmXYLPs較少(表2)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，ZmXYLP1具有3個(gè)氧連接的糖修飾位點(diǎn)，而ZmXYLP14具有1個(gè)氮連接的糖修飾位點(diǎn)和2個(gè)氧連接的糖修飾位點(diǎn)。而這兩個(gè)基因的表達(dá)模式也存在明顯差異(圖2和圖3)。ZmXYLP7和ZmXYLP8具有同一類氧連接的糖修飾位點(diǎn)，但是數(shù)量存在差異。同時(shí)兩者的表達(dá)部位也相同，但是表達(dá)量不同。雖然ZmXYLP9與ZmXYLP7/8同屬第二類ZmXYLP，但是其氧連接的糖修飾位點(diǎn)和數(shù)量明顯多于后兩者，而ZmXYLP9的表達(dá)部位也多于后兩者。ZmXYLP6/15與ZmXYLP7/8類似，具有的氧連接糖修飾位點(diǎn)多的ZmXYLP6表達(dá)水平高于位點(diǎn)少的ZmXYLP15。ZmXYLP11具有多達(dá)19個(gè)糖修飾位點(diǎn)，ZmXYLP12的糖修飾位點(diǎn)次于ZmXYLP11。這暗示著這兩個(gè)蛋白的糖基化程度可能遠(yuǎn)高于其他蛋白，其總蛋白的分子結(jié)構(gòu)也可能更加復(fù)雜。聯(lián)系這兩個(gè)蛋白的表達(dá)模式(圖2、圖3)，上述結(jié)果推測(cè)ZmXYLPs蛋白糖基側(cè)鏈對(duì)于該類蛋白的功能可能起著決定作用。本研究結(jié)果表明，ZmXYLPs可能并不僅僅在玉米維管組織發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮作用，部分基因功能可能還涉及玉米的生殖發(fā)育過(guò)程。本研究為后繼進(jìn)一步通過(guò)功能研究確定ZmXYLPs基因家族成員的具體生物學(xué)功能提供重要線索。