董瑩瑩，胡重怡，葉 航，朱啟盛，朱作為，郭 平，張文中，王 棟

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,南昌330045； 2.江西省食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，南昌 330001；3.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，南寧 530002； 4.江西齊云山油茶科技有限公司，江西 贛州 341000)

油茶籽油，又名山茶油、茶油，其脂肪酸組成與“液體黃金”橄欖油尤為相似[1-2]，其還富含角鯊烯、甾醇等三萜類化合物。三萜類化合物對(duì)人體的營(yíng)養(yǎng)保健起著重要的作用，如具有降低血清膽固醇水平，預(yù)防心臟病及抗炎、抗癌等作用[3-5]。目前，油茶籽油三萜類化合物研究大多集中在菜油甾醇、谷甾醇、豆甾醇等幾種常見(jiàn)甾醇，而對(duì)其他三萜類化合物并未深入研究[6]。為關(guān)注油茶籽油精煉加工過(guò)程中三萜類化合物含量變化，本研究以正己烷為洗脫劑，采用中性氧化鋁柱層析提取分離不同精煉工序油茶籽油中三萜類化合物，并利用GC-MS測(cè)定不同精煉工序的油茶籽油中三萜類化合物含量，研究精煉過(guò)程對(duì)三萜類化合物含量的影響，對(duì)全面認(rèn)識(shí)油茶籽油的營(yíng)養(yǎng)具有重要意義，并為后續(xù)開(kāi)展油茶籽油適度精煉提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

油茶籽浸出毛油及其脫酸油、脫色油、脫臭油、成品油，各6批次，由江西齊云山油茶科技有限公司提供。

角鯊烯、膽甾烷醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、β-香樹(shù)脂醇、羽扇豆醇、環(huán)阿屯醇、熊果醇、樺木醇、無(wú)水嘧啶，美國(guó)Sigma公司；羊毛甾醇，美國(guó)Avanti公司；中性氧化鋁(薄層用，F(xiàn)CP200～300目)；氫氧化鉀、無(wú)水乙醇，分析純；正己烷，色譜純，美國(guó)Honeywell公司；0.22 μm濾膜，日本Shimadzu公司；99∶1雙三甲基硅基三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷(99∶1 BSTFA-TMCS)，美國(guó)TCI公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

7890B+7000D氣相色譜-三重四級(jí)桿串接質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；QUINTIX124-1CN電子分析天平(精度≤0.1 mg)，德國(guó)賽多利斯公司；HH-6電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Vortex Wizard渦旋儀，意大利VELP公司；N-EVAP氮吹儀，美國(guó)Organomation公司；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，瑞士Buchi公司；層析柱、冷凝回流管、圓底燒瓶、玻璃試管，四川蜀玻有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用丙酮分別配制1 mg/mL角鯊烯、菜籽甾醇、菜油甾醇、膽甾烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇、β-香樹(shù)脂醇、環(huán)阿屯醇、羽扇豆醇、熊果醇、羊毛甾醇、樺木醇母液。樣品測(cè)定時(shí)，根據(jù)油茶籽油中實(shí)際三萜類化合物濃度，在各三萜類化合物線性范圍內(nèi)將母液配制成分別含有0.2、0.5、1、2、5、10 μg/mL豆甾醇、羽扇豆醇、樺木醇、熊果醇、菜籽甾醇、菜油甾醇，2、5、10、20、50、100 μg/mL角鯊烯、β-谷甾醇、羊毛甾醇，10、25、50、100、250、500 μg/mL環(huán)阿屯醇、β-香樹(shù)脂醇6個(gè)梯度的不同質(zhì)量濃度混標(biāo)，混標(biāo)中加入100 μL內(nèi)標(biāo)(1 mg/mL膽甾烷醇)。氮吹后加入100 μL硅烷化試劑(99∶1 BSTFA-TMCS和等體積無(wú)水嘧啶)衍生試劑，室溫放置15 min，加入1 500 μL正己烷稀釋，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，進(jìn)氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)。以目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 GC-MS條件

1.2.2.1 GC條件

HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為氦氣，流速0.95 mL/min；進(jìn)樣口溫度320℃，進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣；柱升溫程序?yàn)槌跏紲囟?80℃，保持1 min，以4℃/min升到300℃，保持25 min；溶劑延遲時(shí)間20 min。

1.2.2.2 MS條件

電子轟擊離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度300℃，離子源溫度250℃，質(zhì)量掃描范圍(m/z)50～650。每種目標(biāo)化合物定性、定量離子見(jiàn)表1。

表1 目標(biāo)化合物定性、定量離子

1.2.3 中性氧化鋁柱的制備

參照GB/T 25223—2010《動(dòng)植物油脂 甾醇組成和甾醇總量的測(cè)定 氣相色譜法》并稍作改進(jìn)。在20 mL乙醇中加入10 g中性氧化鋁混合，并將混合液倒入層析柱中，使氧化鋁沉降并敲打至無(wú)縫隙，使用前打開(kāi)活塞使乙醇液面到達(dá)氧化鋁頂層時(shí)關(guān)閉，備用。

1.2.4 樣品中三萜類化合物的提取及含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取每批次油茶籽油樣品(0.50±0.01)g，3個(gè)重復(fù)，加入100 μL內(nèi)標(biāo)物(1 mg/mL膽甾烷醇)和2%的氫氧化鉀-乙醇溶液，混勻，75℃下水浴回流1 h后冷卻至室溫，取5 mL皂化液至中性氧化鋁柱，先用5 mL乙醇洗滌不皂化物，后用30 mL正己烷洗脫并控制流速，收集洗脫液。洗脫液在65℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干后復(fù)溶于5 mL正己烷，轉(zhuǎn)移到15 mL玻璃離心小管中，氮吹后加入100 μL硅烷化試劑(99∶1 BSTFA-TMCS和等體積無(wú)水嘧啶)衍生試劑，室溫放置15 min，加入1 500 μL正己烷稀釋，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，進(jìn)樣，按1.2.2條件進(jìn)行GC-MS分析，峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算各三萜類化合物的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS方法學(xué)考察

2.1.1 GC-MS分離

按照1.2.1配制不同質(zhì)量濃度混標(biāo)溶液,采用1.2.2的GC-MS條件，對(duì)11種目標(biāo)化合物混標(biāo)溶液進(jìn)行GC-MS分析，所得GC-MS譜圖如圖1所示。由圖1可以看出，11種目標(biāo)化合物在GC-MS條件下均能有效分離。

注：1.角鯊烯；2.膽甾烷醇；3.菜籽甾醇；4.菜油甾醇；5.豆甾醇；6.羊毛甾醇；7.β-谷甾醇；8.β-香樹(shù)脂醇；9.羽扇豆醇；10.環(huán)阿屯醇；11.熊果醇；12.樺木醇。

2.1.2 線性關(guān)系

11種目標(biāo)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見(jiàn)表2。

表2 11種目標(biāo)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

由表2可以看出，各化合物線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。

2.2 分離純化方法及洗脫劑的優(yōu)化

在NY/T 3111—2017《植物油中甾醇含量的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法》和GB/T 25223—2010《動(dòng)植物油脂 甾醇組成和甾醇總量的測(cè)定 氣相色譜法》兩種方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，對(duì)比了中性氧化鋁柱層析和水-二氯甲烷液液萃取兩種分離純化植物油不皂化物效果，發(fā)現(xiàn)利用中性氧化鋁柱層析分離純化不皂化物，氮吹后干擾物質(zhì)少，省時(shí)省力，并能有效減少有機(jī)試劑的使用，因此采用中性氧化鋁柱層析分離油脂中不皂化物。此外對(duì)乙醚和正己烷提取效果進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正己烷相對(duì)于乙醚提取，各種目標(biāo)化合物峰形較好，最終采用正己烷作為提取溶劑。

2.3 不同精煉工序油茶籽油三萜類化合物含量變化

2.3.1 角鯊烯

角鯊烯是一種開(kāi)鏈三萜類化合物，具有調(diào)控人體膽固醇代謝[7]、抗癌[8]、抗氧化[9]、抗輻射[10]等功能。油茶籽油精煉過(guò)程中角鯊烯含量變化如表3所示。

表3 油茶籽油精煉過(guò)程中角鯊烯含量變化

由表3可以看出，油茶籽毛油中角鯊烯含量最高，為133.26 mg/kg。隨著精煉的進(jìn)行角鯊烯含量降低，在成品油中，角鯊烯含量已降至55.73 mg/kg。與毛油相比，在脫酸、脫色、脫臭過(guò)程中，油茶籽油中角鯊烯含量分別下降16.31%、23.25%、12.29%，其中脫色步驟對(duì)角鯊烯影響較大，脫臭后灌裝為成品油前會(huì)貯藏于成品油罐中數(shù)月，可能導(dǎo)致成品油中角鯊烯含量下降6.33%。油茶籽油精煉過(guò)程中角鯊烯總損失58.18%，與張智敏等[11]報(bào)道油茶籽油精煉至脫臭步驟角鯊烯損失60.55%結(jié)論一致。

2.3.2 甾醇

植物甾醇是含有環(huán)戊烷多氫菲為骨架的一類四環(huán)三萜類化合物，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與動(dòng)物甾醇較為相似。植物甾醇具有抗癌[12-14]、改善血脂異常及預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化[15-17]、抗炎[18]、抗氧化[19]的功效。油茶籽油精煉過(guò)程中甾醇含量變化見(jiàn)表4。

表4 油茶籽油精煉過(guò)程中甾醇含量變化 mg/kg

由表4可以看出，油茶籽浸出毛油總甾醇含量為1 506.59 mg/kg，并在油茶籽油樣品中均未檢測(cè)出菜籽甾醇，相比較毛油，油茶籽脫酸油、脫色油、脫臭油和成品油總甾醇含量分別下降18.10%、17.16%、13.28%和1.78%，脫酸和脫色對(duì)于總甾醇含量影響較大，總甾醇含量經(jīng)過(guò)精煉下降50.33%。油茶籽油中環(huán)阿屯醇和β-谷甾醇含量較高，其中環(huán)阿屯醇受脫色和脫臭影響較大，相比較毛油這兩個(gè)精煉工序造成環(huán)阿屯醇下降36.47%，經(jīng)過(guò)精煉環(huán)阿屯醇總體損失47.00%；而β-谷甾醇受脫酸影響較大，脫酸步驟損失36.56%，經(jīng)過(guò)精煉β-谷甾醇總體損失64.08%。工廠脫色一般采用白土吸附等工藝，三萜類化合物會(huì)隨之損耗，而脫臭主要是真空高溫分離脫臭油，溫度、真空度和時(shí)間均會(huì)影響油脂中三萜類化合物的損耗，尤其在250℃高溫條件下三萜類化合物易揮發(fā)造成損耗。

2.3.3 其他三萜類化合物含量

油茶籽油精煉過(guò)程中β-香樹(shù)脂醇和羽扇豆醇含量變化見(jiàn)表5。

表5 油茶籽油精煉過(guò)程中β-香樹(shù)脂醇和羽扇豆醇含量變化 mg/kg

由表5可以看出，與毛油相比，在精煉過(guò)程中，油茶籽脫酸油、脫色油、脫臭油和成品油中β-香樹(shù)脂醇含量分別下降11.52%、7.49%、7.48%、8.45%，整個(gè)精煉過(guò)程β-香樹(shù)脂醇含量下降34.94%。而羽扇豆醇含量在精煉過(guò)程中略有升高，具體原因還需進(jìn)一步探明。各精煉工序油茶籽油中均未檢出α-香樹(shù)脂醇的代謝產(chǎn)物熊果醇和羽扇豆醇的代謝產(chǎn)物樺木醇。

β-香樹(shù)脂醇和羽扇豆醇是植物中合成三萜皂苷的兩個(gè)重要的前體物質(zhì)，近年來(lái)已有報(bào)道分離鑒定油茶中三萜皂苷，目前已分離的油茶三萜皂苷均來(lái)自于從β-香樹(shù)脂醇代謝而來(lái)的齊墩果烷型三萜皂苷[20-23]。結(jié)合本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)β-香樹(shù)脂醇是油茶中三萜皂苷的主要代謝通路。

3 結(jié) 論

本文采用GC-MS測(cè)定油茶籽油精煉過(guò)程中三萜類化合物含量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)油茶籽油中環(huán)阿屯醇和β-香樹(shù)脂醇含量較高，油茶籽油中大部分三萜類化合物隨著精煉的進(jìn)行含量均降低，其中角鯊烯含量受脫色過(guò)程影響較大，β-谷甾醇、β-香樹(shù)脂醇含量受脫酸影響較大，環(huán)阿屯醇受脫色和脫臭影響較大。受制于已有標(biāo)準(zhǔn)品的限制，本文檢測(cè)到的三萜類化合物種類仍然有限，還需要后續(xù)進(jìn)一步挖掘，此外如何通過(guò)改進(jìn)精煉工藝在去雜降害的情況下盡量保留油茶籽油中微量有益化合物將是下一步油茶籽油產(chǎn)業(yè)的焦點(diǎn)。