李 闖，趙國群，李 陽，張 輝，馮鳳琴

(1.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊050000； 2.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州310000)

油脂是食品的重要組成部分，作為機(jī)體不可缺少的營養(yǎng)元素之一，一方面要為機(jī)體提供能量，另一方面發(fā)揮著特殊的健康作用。隨著人們生活水平的提高，過多攝入油脂導(dǎo)致的肥胖和不良的生活方式已經(jīng)成為了心血管疾病的重要危險因素[1]。中長鏈脂肪酸甘油三酯(MLCT)是一類結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(SLs)，因其同時具備中鏈和長鏈脂肪酸，在為機(jī)體供能的同時避免了脂肪堆積，從而利于健康，在食品工業(yè)中應(yīng)用越來越廣[2]。根據(jù)甘油三酯(TAGs)在體內(nèi)代謝的特點(diǎn)，MLM型MLCT位于sn-1,3位的中鏈脂肪酸可以快速水解代謝[3]，具有更好的代謝優(yōu)勢，一直以來都是MLCT的主要研究方向。

月桂酸是一種特殊的脂肪酸，在中鏈脂肪酸中其碳鏈最長，雖然屬于飽和脂肪酸，但不具有心血管疾病風(fēng)險。研究表明，月桂酸占脂肪酸50%左右的椰子油具有很好的健康功能，南亞等一些地區(qū)使用椰子油作為主要的食用油脂，其心血管疾病風(fēng)險降低[4-5]。除此之外，椰子油還有一些特殊功能，如抑菌、消炎[6-7]，而且在對結(jié)腸癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡中月桂酸表現(xiàn)出了很好的效果[8]。在MLCT的研究中，月桂酸越來越受到重視，一方面富含月桂酸的中鏈脂肪酸甘油三酯被引入市場，用于色拉油和烹飪，具有很好的功能優(yōu)勢，如促進(jìn)心腦血管的健康。另一方面，相較于利用傳統(tǒng)的辛酸和癸酸合成的MLCT，富含月桂酸的MLCT煙點(diǎn)更高，應(yīng)用范圍更廣[9]。這些研究表明，月桂酸作為中鏈脂肪酸合成MLCT具有很好的應(yīng)用前景。人乳脂中有20%左右的棕櫚酸，且主要位于TAGs sn-2位，研究表明sn-2棕櫚酸油脂可以促進(jìn)鈣的吸收，預(yù)防因sn-1,3位棕櫚酸與鈣離子結(jié)合造成的便秘[10-11]。除此之外，sn-2棕櫚酸油脂還可以提高骨骼生長速度,有利于腸道益生菌群生長，提高骨礦物質(zhì)含量及密度,促進(jìn)大腦發(fā)育等[12]。所以，LaPLa(La，月桂酸；P，棕櫚酸)型甘油三酯具有很好的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢。雖然椰子油中含有大量月桂酸和部分棕櫚酸，但是分子中同時含有兩個月桂酸和一個棕櫚酸的TAGs含量很低，約為1.51%，并且月桂酸和棕櫚酸并沒有特定位點(diǎn)[13]。富含LaPLa的MLCT具有典型的代謝和功能優(yōu)勢，一方面含有較多具有健康功能的中鏈脂肪酸月桂酸，另一方面含有較多的sn-2位棕櫚酸，具有很好的應(yīng)用前景。

國內(nèi)對于MLCT的研究相對較晚，最常用的方法是酶催化中鏈脂肪酸甘油三酯與長鏈脂肪酸甘油三酯反應(yīng)的酯交換法。這種方法原料利用率高，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，但合成的目的產(chǎn)物脂肪酸位置特異性差。隨著對MLM型MLCT的深入研究，酸解法在追求脂肪酸位置特異性方面表現(xiàn)出了更大的優(yōu)勢。本研究設(shè)計了一種以月桂酸為酰基供體合成的新型MLCT，即以sn-1,3位特異性脂肪酶催化月桂酸酸解棕櫚硬脂合成富含LaPLa的MLCT，篩選了脂肪酶，對合成工藝進(jìn)行了優(yōu)化，檢測了合成的MLCT理化性質(zhì)，為開發(fā)新型功能性MLCT奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

固定化脂肪酶RM IM、 TL IM，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；固定化脂肪酶AO IM，杭州康源食品科技有限公司；58℃棕櫚硬脂(PS)，南京新實(shí)力食品科技有限公司；月桂酸， 阿拉丁公司；脂肪酸甲酯混標(biāo)，美國Sigma公司；正己烷，氣相色譜純，阿拉丁公司；其他試劑均為分析純或色譜純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

GC-2014氣相色譜儀，日本島津；7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫；THZ-82水浴恒溫振蕩器，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DSC Q200差示掃描量熱儀，美國TA公司；BSA224S分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；L600-A離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 月桂酸酸解棕櫚硬脂合成MLCT

在100 mL圓底燒瓶中加入一定摩爾比的PS和月桂酸，充入氮?dú)猓w上翻口塞，置于一定溫度恒溫水浴振蕩器一段時間，待反應(yīng)底物混合均勻且呈液態(tài)后，加入一定量的固定化脂肪酶，再次充入氮?dú)獗Ｗo(hù)，蓋上翻口塞，200 r/min條件下反應(yīng)一定時間，得到產(chǎn)物。每個試驗做3組平行。根據(jù)產(chǎn)物中LaPLa含量對合成條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.2 MLCT的純化

MLCT的純化在潘向昆等[14]的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改，具體為酸解反應(yīng)結(jié)束后，過濾掉固定化酶，收集混合物料于分液漏斗中，加入混合物料12倍體積的正己烷和5倍體積的95%乙醇，加3滴酚酞試劑混勻，滴加0.5 mol/L KOH溶液并不斷搖晃，直到溶液出現(xiàn)粉紅色且30 s內(nèi)不褪色，振搖1 min，靜置收集正己烷相，重復(fù)操作，合并兩次收集的正己烷相，用飽和NaCl溶液洗滌，旋蒸除去有機(jī)溶劑得較為純凈的MLCT。

1.2.3 脂肪酸組成的測定

參照GB 5009.168—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測定》以及GB/T 24894—2010《動植物油脂 甘三酯分子2-位脂肪酸組分的測定》進(jìn)行脂肪酸甲酯化和氣相色譜分析。以標(biāo)準(zhǔn)品保留時間定性，面積歸一化法定量，確定脂肪酸組成及含量。

GC條件：GC-2014氣相色譜儀；DB-23毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)(美國安捷倫)；FID檢測器；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測器溫度300℃；載氣為氮?dú)?；分流?0∶1；進(jìn)樣量1 μL；柱溫程序為初始溫度100℃，保持2 min，以10℃/min升至160℃，保持4 min，以10℃/min升至210℃，保持5 min，再以10℃/min升至240℃，保持10 min，整個分析時長35 min。

1.2.4 甘油三酯分析及LaPLa含量測定

取10 μL樣品兩份，分別加入1 mL正己烷，混勻后過0.22 μm有機(jī)膜，進(jìn)氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測和氣相色譜儀檢測。

對甘油酯和游離脂肪酸通過氣質(zhì)聯(lián)用定性并確定其出峰順序。對比出峰順序，結(jié)合氣相色譜圖，不積分游離脂肪酸峰面積，采用面積歸一化法計算對應(yīng)甘油三酯含量。每個試驗做3組平行。LaPLa(參照GB 30604—2015《食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯》，以C40甘油三酯計)含量按下式計算。

(1)

式中：X為LaPLa的含量；S1為氣相色譜圖中LaPLa對應(yīng)的峰面積；S2為氣相色譜圖中所有甘油酯對應(yīng)的峰面積總和。

GC-MS條件：7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀；DB-1HT色譜柱(15 m×0.25 mm×0.10 μm)(美國安捷倫)；進(jìn)樣口溫度320℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比10∶1；恒流模式，柱流速1 mL/min；柱溫程序為初始溫度200℃，以5℃/min升到350℃，保持5 min；EI離子源；離子源溫度300℃；四級桿溫度200℃；質(zhì)量數(shù)(m/z)掃描范圍33～1 000 u。

GC條件：GC-2014氣相色譜儀；DB-1HT色譜柱(15 m×0.25 mm×0.10 μm)(美國安捷倫)；進(jìn)樣口溫度320℃；FID檢測器溫度370℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比10∶1；柱壓力200 kPa；柱溫程序為初始溫度200℃，以8℃/min升到350℃，保持5.25 min。

1.2.5 結(jié)晶熔融特性分析

用DSC Q200差示掃描量熱儀，參照Korma等[15]的方法測定甘油三酯的熔融起始溫度和結(jié)晶起始溫度。首先，稱量8～12 mg的樣品置鋁盒并密封。樣品在30℃/min下快速從室溫加熱至80℃，并保持10 min，破壞原有的晶體結(jié)構(gòu)。然后以10℃/min冷卻至-40℃，保溫30 min。最后，以10℃/min加熱至80℃。所有樣品重復(fù)測定3次，取平均值。

1.2.6 理化性質(zhì)檢測

酸價測定參照GB 5009.229—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價的測定》；過氧化值測定參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測定》；碘值測定參照GB/T 5532—2008《動植物油脂 碘值的測定》。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

試驗所得的數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為顯著性差異。使用OriginPro 8.0和GraphPad Prism 6.0進(jìn)行繪圖分析。數(shù)據(jù)表示為“x±s”(n=3)。

2 結(jié)果與討論

2.1 PS脂肪酸組成(見表1)

表1 PS脂肪酸組成 %

PS是從棕櫚油中分提出來的一種油脂，其特點(diǎn)是含有大量的棕櫚酸和部分油酸，且sn-2位棕櫚酸含量很高，這種特殊的組成結(jié)構(gòu)使其成為合成結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的很好的天然原料[16-17]。由表1可以看出，PS中脂肪酸種類較少，不含月桂酸，棕櫚酸含量達(dá)到73.71%，sn-2位棕櫚酸含量也達(dá)到了66.83%。這種sn-2位含有大量棕櫚酸的特殊結(jié)構(gòu)，成為合成高含量LaPLa的基礎(chǔ)。

2.2 固定化脂肪酶對合成LaPLa的影響(見圖1)

原料中使用的是熔點(diǎn)為58℃的棕櫚硬脂，所以將3種酶的反應(yīng)溫度都設(shè)在60℃。由圖1可以看出，3種酶表現(xiàn)出了不同的活力和反應(yīng)程度，即反應(yīng)速率和終產(chǎn)物中LaPLa含量。其中TL IM的活力和反應(yīng)程度最低，LaPLa含量上升速度較慢，在最后反應(yīng)達(dá)到平衡時，其LaPLa含量較低，為(22.51±0.41)%。RM IM和AO IM兩種酶在反應(yīng)達(dá)到平衡時，其LaPLa含量沒有顯著性差異，分別是(32.78±0.50)%和(32.38±0.30)%，但前者的反應(yīng)時間(8 h)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于后者(4 h)，AO IM表現(xiàn)出了很高的催化效率。需要注意的是，AO IM隨著反應(yīng)的進(jìn)行，LaPLa含量會下降，這是因為有三月桂酸甘油酯(LaLaLa)的生成。試驗中，當(dāng)LaPLa含量趨于平衡時，隨著反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，LaLaLa開始生成且含量越來越高，這可能是因為反應(yīng)后期酰基遷移的影響，以及過高的月桂酸影響了脂肪酶特異性，這與Zhang等[18]的試驗結(jié)果相符合。因此，控制好反應(yīng)時間，AO IM可以滿足此合成工藝，后續(xù)工藝優(yōu)化選取AO IM 作為生物催化劑。

注：反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度60℃，底物(棕櫚硬脂與月桂酸，下同)摩爾比1∶8，酶載量8%(相對于底物質(zhì)量，下同)。

2.3 AO IM催化合成MLCT工藝優(yōu)化

2.3.1 反應(yīng)溫度對合成LaPLa的影響(見圖2)

注：反應(yīng)條件為底物摩爾比1∶8，酶載量4%。

在PS的基礎(chǔ)上，因為有月桂酸的存在，使整個反應(yīng)體系熔點(diǎn)降低，在50℃下也能熔融。溫度一方面會影響體系的黏度，進(jìn)而影響分子之間的相互作用，另一方面會影響酶的活力[19]。由圖2可以看出，隨著反應(yīng)溫度從50℃不斷地升高，酶的活力越來越強(qiáng)，反應(yīng)達(dá)到平衡所用的時間越來越短，65℃時最短，為3 h。當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到70℃時酶的活力下降，反應(yīng)達(dá)到平衡的時間延長，反應(yīng)速率降低。這可能是因為溫度過高，使部分酶失活，整體催化能力降低。所以，選擇65℃作為酶催化合成試驗的下一步優(yōu)化基礎(chǔ)。

2.3.2 酶載量對合成LaPLa的影響(見圖3)

注：反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度65℃，底物摩爾比1∶8。

通常情況下，反應(yīng)速率會隨著酶載量的升高而升高，直到達(dá)到過載點(diǎn)為止，過高的酶載量會促進(jìn)底物擴(kuò)散，繼而抑制酶的活性[20]。由圖3可以看出，隨著酶載量的不斷升高，反應(yīng)速率越來越快，達(dá)到平衡時間越來越短，但是反應(yīng)達(dá)到平衡時LaPLa含量沒有顯著性差異，說明酶載量對LaPLa合成速率影響大，對反應(yīng)程度影響小，即對終產(chǎn)物含量影響小，這與Araújo等[21]報道的結(jié)果吻合。12%酶載量合成反應(yīng)最先達(dá)到平衡，1.5 h時LaPLa含量可達(dá)到(32.43±0.87)%，與10%酶載量合成反應(yīng)1.5 h的結(jié)果((31.19±0.03)%)沒有顯著性差異，而與8%酶載量合成反應(yīng)1.5 h的結(jié)果((28.76±0.16)%)有顯著性差異。這說明，酶載量從10%提高到12%已經(jīng)不能顯著提高反應(yīng)速率，過高的酶載量使反應(yīng)快速平衡，同時加快了?；w移[22]。另外，考慮到脂肪酶的成本，選擇10%為最適酶載量，作為酶催化合成試驗的下一步優(yōu)化基礎(chǔ)。

2.3.3 底物摩爾比及反應(yīng)時間對合成LaPLa的影響(見圖4)

注：反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度65℃，酶載量10%。

由圖4可以看出，隨著底物摩爾比的不斷升高，反應(yīng)平衡時LaPLa含量越來越高，反應(yīng)在2.5 h時基本都達(dá)到了平衡，說明底物摩爾比對LaPLa合成速率影響小，對終產(chǎn)物含量影響大。底物摩爾比為1∶12時反應(yīng)2.5 h時達(dá)到平衡，LaPLa含量為(41.12±0.18)%，反應(yīng)3 h LaPLa含量升高但沒有顯著性差異。底物摩爾比為1∶10反應(yīng)2.5 h達(dá)到平衡且終產(chǎn)物含量最高，為(40.59±0.29)%，與底物摩爾比1∶12的LaPLa含量相比沒有顯著性差異，而與底物摩爾比1∶8的相比有顯著性差異，故1∶10是該酶促合成反應(yīng)的底物摩爾比飽和值。同時，當(dāng)?shù)孜锬柋仍黾拥?∶10和1∶12時，在反應(yīng)的起始階段反應(yīng)速率較慢，這可能是過高的底物摩爾比導(dǎo)致pH過低，影響了酶的活性[23-24]，而隨著反應(yīng)的進(jìn)行反應(yīng)速率又逐漸加快。故底物摩爾比和反應(yīng)時間的優(yōu)化結(jié)果分別為1∶10和2.5 h。

綜上所述，月桂酸酸解棕櫚硬脂合成富含LaPLa的MLCT的最佳條件為：底物摩爾比1∶10，反應(yīng)溫度65℃，酶載量10%，反應(yīng)時間2.5 h。在最佳條件下，LaPLa的含量為40.59%。

2.4 純化后MLCT脂肪酸和甘油三酯組成

在最佳工藝條件下合成并純化MLCT，測定其脂肪酸組成，結(jié)果見表2。

表2 純化后MLCT脂肪酸組成 %

由表2可以看出，純化后MLCT月桂酸的摻入率達(dá)到了50%，同時反應(yīng)中發(fā)生了酰基遷移，部分月桂酸摻入到了sn-2位。sn-2位棕櫚酸含量有所下降，但仍達(dá)到了59.91%。

反應(yīng)后的混合物經(jīng)脫酸純化后，其甘油三酯組成和含量與純化前基本吻合。純化后LaPLa的含量為(41.64±0.51)%，LaLaLa的含量低于8%，PPP的含量低于1%。

2.5 純化后MLCT的熔融特性(見圖5)

油脂的熔融特性與脂肪酸和甘油三酯的類型有關(guān)，短鏈、中鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸含量高的油脂比長鏈脂肪酸含量高的油脂熔融溫度低[25]。由圖5A可以看出，MLCT結(jié)晶起始溫度(17.58℃)較PS(42.04℃)低，在14.71℃處觀察到結(jié)晶峰，說明MLCT具有更低的結(jié)晶點(diǎn)，這些都與月桂酸的摻入有關(guān)。由圖5B可以看出，MLCT熔融溫度較PS大幅降低，熔融峰從58.24℃降為33.74℃，熔融起始溫度為23.97℃，曲線的基線相對平滑，這說明經(jīng)酶促酸解反應(yīng)后形成了新的甘油三酯分子(MLCT)，且該油脂成分組成相對單一。熔融峰為33.74℃，低于人體溫度(36～37℃)，這一特性有助于其在嬰幼兒食品中的應(yīng)用，可在體溫下完全融化進(jìn)入人體代謝，有利于消化吸收。

2.6 純化后MLCT的理化性質(zhì)

在最佳工藝條件下合成并純化MLCT，測定其理化性質(zhì)，結(jié)果見表3。

表3 PS和MLCT理化性質(zhì)

由表3可以看出，合成的MLCT經(jīng)純化后酸價有所下降，但和PS相比沒有顯著性差異(P>0.05)。過氧化值表示油脂的氧化程度，是衡量油脂品質(zhì)的一個重要指標(biāo)。MLCT較PS過氧化值顯著(P<0.05)升高，這可能是因為在試驗過程中高溫和酸性環(huán)境等加快了油脂的氧化，使過氧化值升高。碘值是衡量油脂不飽和度的指標(biāo)，PS中部分不飽和脂肪酸被月桂酸取代，造成MLCT碘值顯著(P<0.05)低于PS。

3 結(jié) 論

本研究通過月桂酸酸解PS合成一種結(jié)構(gòu)相對單一的MLCT，即富含LaPLa的MLCT，優(yōu)化了合成工藝，檢測了純化后MLCT的理化性質(zhì)。結(jié)果表明：固定化脂肪酶AO IM具有良好的催化性能，在反應(yīng)溫度65℃、酶載量10%、底物摩爾比1∶10、反應(yīng)時間2.5 h的工藝條件下，LaPLa的含量可達(dá)到40.59%；與PS相比，純化后的MLCT酸價和碘值有所降低，過氧化值顯著升高，結(jié)晶起始溫度和熔融起始溫度都有所降低。合成的富含LaPLa的MLCT具有典型的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即盡可能將月桂酸的功能與MLM型MLCT代謝優(yōu)勢結(jié)合起來，同時sn-2位保留大量棕櫚酸，有利于在嬰幼兒食品中的應(yīng)用，為新型MLCT的合成提供了研究思路。