白瑩，張清陽，韓海銀，張偉峰，楊俊琦，張輝，劉玉芳

(河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038)

隨著人們生活水平的提高，豬肉品質(zhì)引起了生產(chǎn)者和消費者的重視。如何提高豬肉品質(zhì)是養(yǎng)豬業(yè)和豬遺傳育種工作者的工作重點和研究目標，而這兩方面的提高歸根結(jié)底是要深入研究豬脂肪沉積和肌肉的生長發(fā)育[1]。脂肪沉積和肌肉的生長發(fā)育是十分復(fù)雜的過程，涉及大批基因的表達及網(wǎng)絡(luò)式的調(diào)控。已有研究表明，過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子lA(peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator 1A，PPARGC1A)是一個非常值得關(guān)注的基因，其最早在小鼠棕色脂肪cDNA文庫篩選中被發(fā)現(xiàn)并報道[2]。作為關(guān)鍵性的核轉(zhuǎn)錄輔激活因子PPARGC1A可以和許多不同種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，參與一系列有序的代謝過程，在調(diào)節(jié)線粒體生物合成、糖代謝、脂肪酸氧化、肌肉纖維類型轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮著重要的作用[3-5]。

豬PPARGC1A基因定位于8號染色體，與脂肪酸合成和胴體性狀相關(guān)的數(shù)量性狀位點(QTL)共同定位[6-7]。研究表明PPARGC1A基因存在與板油、背膘厚和肉色等顯著相關(guān)的單核苷酸多態(tài)位點(single nucleotide polymorphisms,SNPs)[8-11]。同時，PPARGC1A基因在不同組織和生長階段中的表達具有不同的模式。PPARGC1A基因在4月齡八眉豬肝臟、心臟和肌肉中表達最高，而在皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪中的表達最低[12]。太湖豬和長白豬肌肉組織中PPARGC1A基因的表達與背膘厚、脂肪細胞體積和肌纖維面積均呈負相關(guān)，脂肪組織中的表達與背膘厚、脂肪細胞體積和肌纖維面積呈正相關(guān)[13]。Li等[8]檢測了PPARGC1A基因在滇南小耳豬和藏豬不同組織中的表達情況，結(jié)果顯示PPARGC1A在背最長肌中表達最高，肝臟中次之，背膘中最低。在牛、羊和雞中檢測到PPARGC1A基因存在與生長性狀(體重、日增重等)顯著相關(guān)的多態(tài)性位點[14-16]，但在豬中PPARGC1A基因與日增重和飼料轉(zhuǎn)化率的相關(guān)性還鮮有報道。

研究發(fā)現(xiàn)豬PPARGC1A基因啟動子區(qū)存在g.17949513G>A多態(tài)性位點，該位點與肌纖維類型和數(shù)量顯著相關(guān) (P<0.05)[17]。該位點是否與生長性狀和飼料轉(zhuǎn)化率相關(guān)，是否會引起基因表達的變化還有待研究。本研究探討PPARGC1A基因g.17949513G>A位點在杜洛克豬、長白豬以及大約克豬中的基因頻率和基因型頻率，分析該SNP位點不同基因型與達目標體重日齡、平均日增重、背膘厚和料重比的相關(guān)性，并檢測該基因在大約克豬和金華豬不同組織中的表達，以探究該位點對豬生長性狀的效應(yīng)，以期為育種工作中利用PPARGC1A基因標記改良豬生長性狀提供一定的基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究試驗群體包括126頭杜洛克豬、185頭長白豬和224頭大約克豬，所選個體3代之內(nèi)沒有親緣關(guān)系。試驗群體來自河北雙鴿美丹畜牧科技有限公司，豬群的飼養(yǎng)管理條件基本一致，不同品種豬群均分3個批次進行性狀測定。采集試驗群體的耳組織樣，并將其放于裝有75%酒精的試劑盒中帶回實驗室，-20 ℃保存?；虮磉_試驗中選取90日齡的大約克豬和金華豬各6頭，屠宰后采取背脂和背最長肌組織樣本，并迅速置于液氮保存，-80 ℃低溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 性狀測定與分析

本研究采用美國奧斯本自動測定系統(tǒng)和MylabTouch超聲診斷系統(tǒng)對試驗群體進行性狀測定。分析的性狀包括達30 kg體重日齡、達50 kg體重日齡、達100 kg體重日齡、30～50 kg平均日增重、50～100 kg平均日增重、30～100 kg平均日增重、100 kg體重活體背膘厚和料重比。達30 kg體重日齡、達100 kg體重日齡、30～100 kg平均日增重和100 kg體重活體背膘厚的校正和計算方法參照種豬生產(chǎn)性能測定規(guī)程(NY/T 822-2004)和《家畜育種學(xué)》[18]；達50 kg體重日齡參照文獻中的公示進行校正[19]；30～50 kg平均日增重和50～100 kg平均日增重根據(jù)校正的達30 kg體重日齡、達50 kg體重日齡、達100 kg體重日齡進行計算。

1.3 主要試劑

動物組織DNA提取試劑盒、總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。瓊脂糖、DNA Marker Ⅰ等試劑購自北京匯天東方有限公司。

1.4 基因組DNA的提取及擴增

用DNA提取試劑盒從耳組織中提取基因組DNA。用豬特異性引物(F：5′-TGGAACATTATGGGCACTCA-3′，R：5′-AACCTGTTTGCTCTATGTCGTG-3′)對PPARGC1A基因進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為2×TaqPCR Mix 10 μL，上下游引物各0.2 μL，DNA模板 1 μL，補足ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序為95 ℃ 預(yù)變性10 min，95 ℃ 變性30 s，58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，36個循環(huán)，再延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海生工生物科技有限公司進行測序，對目的基因的多態(tài)性進行分析。

1.5 組織總RNA提取與cDNA合成

將采集的組織進行研磨，按照動物組織總RNA提取試劑盒說明書的步驟進行組織總RNA提取。利用NanoDrop 2000分光光度計檢測提取RNA濃度和純度。對合格的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄步驟按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法進行反轉(zhuǎn)錄，質(zhì)控合格后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測PPARGC1A基因mRNA相對表達量

分別取金華豬和大約克豬背脂和背最長肌組織的cDNA，以GAPDH基因為內(nèi)參，實時熒光定量PCR檢測PPARGC1A基因的表達。反應(yīng)體系為25 μL：2×qPCR Mix 12.5 μL，7.5 μmol/L上下游引物2.0 μL(表1)，cDNA 2.5 μL，RNase-free水8.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，10 min為模板的預(yù)變性階段；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)為模板的擴增階段；60 ℃→95 ℃，每15 s緩慢升溫0.3 ℃，建立熔解曲線階段。

表1 熒光定量PCR引物

1.7 統(tǒng)計分析與數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 豬PPARGC1A基因啟動子區(qū)g.17949513G>A多態(tài)位點檢測

利用PCR進行片段擴增，采用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果顯示PPARGC1A基因PCR擴增產(chǎn)物片段的長度為943 bp，條帶單一、清晰明亮，符合預(yù)期的片段大小，沒有非特異性條帶。PPARGC1A基因的PCR擴增片段測序結(jié)果顯示，在3個不同的試驗豬種中存在g.17949513G>A多態(tài)性位點，共檢測到GG、GA和AA三種基因型(圖1)。

圖1 PPARGC1A基因g.17949513G>A多態(tài)位點

2.2 豬PPARGC1A基因多態(tài)位點的基因和基因型頻率及群體遺傳特性

杜洛克豬、長白豬和大約克豬PPARGC1A基因g.17949513G>A位點的基因和基因型頻率如表2所示。從基因型頻率來看，長白豬中GG基因型頻率最高(0.783 8)，在杜洛克豬和大約克豬中頻率最高的基因型為GA(分別為0.476 2、0.678 6)，3個豬品種中AA基因型頻率最低(分別為0.222 2、0.032 4、0.125 0)。從基因頻率來看，杜洛克豬、長白豬和大約克豬中等位基因G的頻率高于A，χ2檢驗的結(jié)果顯示，g.17949513G>A位點在杜洛克豬和長白豬中符合Hardy-Weinberg平衡 (P>0.05)，而在大約克豬中未達到Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)。從多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)的數(shù)值來看，杜洛克豬和大約克豬(分別為0.373 4和0.373 7)處于中度多態(tài)(0.25

表2 不同豬品種PPARGC1A基因g.17949513G>A位點的基因和基因型頻率

2.3 豬PPARGC1A基因多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

g.17949513G>A位點不同基因型與達目標體重日齡的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示(表3)，在3個豬品種中，GG基因型個體達到目標體重日齡均低于AA基因型和GA基因型個體，且在杜洛克豬中，GG基因型個體達到100 kg體重日齡顯著低于AA基因型和GA基因型個體(P<0.05)。

表3 PPARGC1A基因g.17949513G>A位點不同基因型與達到目標體重日齡關(guān)聯(lián)分析

與平均日增重關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示(表4)，在杜洛克豬中，GG基因型個體30～100 kg平均日增重極顯著高于AA基因型個體(P<0.01)，與GA基因型個體之間差異不顯著(P>0.05)。在長白豬中，GG基因型個體50～100 kg平均日增重顯著高于AA基因型個體(P<0.05)，與GA基因型個體之間差異不顯著(P>0.05)。在大約克豬中，GG基因型個體的平均日增重高于其它兩種基因型，但不同基因型個體之間日差異不顯著(P>0.05)。

表4 PPARGC1A基因g.17949513G>A位點不同基因型與平均日增重關(guān)聯(lián)分析

與100 kg體重活體背膘厚和料重比關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示(表5和表6)，在3個豬品種中，不同基因型個體之間的100 kg體重活體背膘厚和料重比差異不顯著(P>0.05)。在杜洛克豬和大約克豬中，GG基因型個體的料重比低于AA和GA基因型個體。但在長白豬中，料重比最低的是GA基因型個體。

表5 PPARGC1A基因g.17949513G>A位點不同基因型與背膘厚關(guān)聯(lián)分析

表6 PPARGC1A基因g.17949513G>A位點不同基因型與料重比關(guān)聯(lián)分析

2.4 PPARGC1A基因在金華豬和大約克豬背脂和背最長肌組織中的表達

利用RT-qPCR技術(shù)檢測了PPARGC1A基因在大約克豬和金華豬中的表達情況。定量結(jié)果顯示，PPARGC1A基因在大約克豬背脂和背最長肌組織中的表達顯著高于金華豬(P<0.05)，見圖2。同時，通過PCR直接測序的方法檢測到定量所用的6頭金華豬在g.17949513G>A位點的基因型為AA，而6頭大約克豬在該位點的基因型為GG或GA。

圖2 PPARGC1A基因相對表達量

3 討論

PPARGC1A是一個與動物生長發(fā)育相關(guān)的重要調(diào)控基因。已有研究表明，豬PPARGC1A基因中存在多個與肉質(zhì)性狀和肌纖維類型顯著相關(guān)的SNPs位點[8,11,17]，但與生長性狀和料重比的相關(guān)性還鮮有報道。本研究檢測了PPARGC1A基因啟動子區(qū)多態(tài)位點g.17949513G>A在535頭杜洛克豬、長白豬以及大約克豬中的遺傳結(jié)構(gòu)，并將其與平均日增重、達到目標體重日齡、100 kg體重活體背膘厚和料重比進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，PPARGC1A基因g.17949513G>A位點在本研究試驗群體中存在多態(tài)性。杜洛克豬、長白豬和大約克豬中G等位基因的頻率高于A等位基因，這與Kim等[17]在長白豬和大約克豬中的研究結(jié)果一致。但Kim等[17]發(fā)現(xiàn)在長白豬和大約克豬中GG基因型的頻率高于其他兩種基因型，本研究結(jié)果顯示長白豬中基因型頻率最高的也是GG，而杜洛克豬和大約克豬中GA基因型的頻率最高，造成這種差異的原因可能是群體的來源和數(shù)量不同。

關(guān)聯(lián)分析結(jié)果可以看出，GG基因型個體達目標體重日齡低于AA基因型和GA基因型個體，平均日增重高于AA基因型個體。在杜洛克豬中，GG基因型個體達到100 kg體重日齡顯著低于AA基因型和GA基因型個體，GG基因型個體30～100 kg平均日增重極顯著高于AA基因型個體。在長白豬中，GG基因型個體在50～100 kg平均日增重顯著高于AA基因型個體。同時，PPARGC1A基因在生長速度快的大約克豬背脂和背最長肌組織中的表達要高于生長速度慢的金華豬。已有研究表明，GG基因型與Ⅰ型肌纖維含量和產(chǎn)肉性狀(眼肌面積)顯著正相關(guān)[17]，同時PPARGC1A基因的高表達與Ⅰ型肌纖維含量顯著正相關(guān)[20]。在出生體重不同的豬中，體重大的個體I型肌纖維含量要顯著高于體重小的個體[21]。因此，該位點的變異可能會影響PPARGC1A基因的表達，從而改變肌纖維的類型和含量，對個體的生長發(fā)育有一定的影響。但其具體的作用機制還需要通過細胞和分子水平試驗的進一步驗證。

在3個豬品種中，PPARGC1A基因g.17949513G>A位點的不同基因型個體之間的活體背膘厚差異不顯著，這與Kim等[17]的研究結(jié)果一致。飼料效率對豬養(yǎng)殖業(yè)和經(jīng)濟效益有重要的影響，通過GWAS分析表明PPARGC1A基因可能是飼料效率相關(guān)的一個重要候選基因[22]。在本研究中，g.17949513G>A位點不同基因型與料重比關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，雖然不同基因型個體之間料重比差異不顯著，但在杜洛克豬和大約克豬中，GG基因型個體的料重比低于AA和GA基因型個體。在長白豬中，料重比最低的是GA基因型個體。

4 結(jié)論

豬PPARGC1A基因g.17949513G>A位點與平均日增重和達目標體重日齡相關(guān)。PPARGC1A基因在生長速度快的大約克豬中背脂和背最長肌組織中的表達要高于生長速度慢的金華豬，該基因的差異表達可能影響個體的生長發(fā)育。研究結(jié)果有助于豬生長性狀的遺傳標記開發(fā)及對豬的分子育種具有一定的意義。