許 女 賈瑞娟 李雅茹 張 浩 王如福

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷030801）

益生乳酸菌作為一種調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌群生態(tài)平衡的有益菌，其生理功能是多方面的，主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)腸道菌群，改善腸上皮細(xì)胞屏障功能，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，拮抗病原微生物，促進(jìn)消化吸收，降低血清膽固醇及參與宿主的物質(zhì)代謝等，目前被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和工業(yè)發(fā)酵中。關(guān)于益生乳酸菌的篩選及開(kāi)發(fā)研究多集中在乳制品、發(fā)酵肉制品、泡菜、酒、青貯飼料及人體腸道等方面。研究表明，乳酸菌是山西老陳醋整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌屬，具有抑制雜菌，產(chǎn)生乳酸（老陳醋第2主體酸成分，第1 主成分為醋酸）、乙偶姻（老陳醋重要功能成分川芎嗪的前體），平衡酸味，豐富協(xié)調(diào)香氣，增強(qiáng)食醋生理功能等重要作用[1]，而目前鮮有關(guān)于老陳醋中乳酸菌資源的益生特性及開(kāi)發(fā)應(yīng)用的報(bào)道。

乳酸菌作為食品發(fā)酵劑具有悠久的使用歷史，一直以來(lái)被認(rèn)為是安全的 （Generally recognized as safe，GRAS），而近些年來(lái)關(guān)于傳統(tǒng)發(fā)酵食品來(lái)源乳酸菌安全性的負(fù)面報(bào)道時(shí)有發(fā)生，一些研究表明部分乳酸菌可攜帶抗性基因轉(zhuǎn)移至病原微生物[2]，引起耐藥性問(wèn)題；一些雙歧桿菌具有體外降解粘蛋白的毒力能力[3]；隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)某些菌株能夠產(chǎn)生生物胺等有害代謝產(chǎn)物[4]。開(kāi)展乳酸菌的安全性評(píng)價(jià)，對(duì)提高乳酸菌制品的質(zhì)量安全以及保證人體健康具有重要意義。本文主要對(duì)山西老陳醋源乳酸菌進(jìn)行益生特性篩選和系統(tǒng)安全評(píng)價(jià)，為其開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

健康昆明小白鼠，山西西科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，清潔級(jí)，體重（20±2）g。

乳酸菌菌株，分離自山西老陳醋醋醅，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生物工程實(shí)驗(yàn)室保存；MRS 培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；膽鹽、膽固醇、DPPH、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、生物胺、γ-氨基丁酸（GABA）、乙偶姻，北京索萊寶科技有限公司。細(xì)菌提基因組試劑盒，北京博邁德科技發(fā)展有限公司；Taq DNA 聚合酶、dNTP、10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)緩沖液、10×Loading Buffer，大連寶生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的益生特性測(cè)定 乳酸菌菌株的耐酸、耐膽鹽特性，DPPH、膽固醇的清除能力，ACE抑制活性，生物胺降解能力及產(chǎn)細(xì)菌素、γ-氨基丁酸和乙偶姻等益生特性試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[5-7]中報(bào)道的方法。

1.2.2 菌株的安全評(píng)價(jià)

1.2.2.1 毒力、產(chǎn)生物胺及耐藥相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增 參考文獻(xiàn)[8-9]等的引物序列，采用PCR 方法對(duì)20 株老陳醋源乳酸菌的毒力基因、生物胺產(chǎn)生相關(guān)基因及耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

1.2.2.2 菌株有害代謝產(chǎn)物評(píng)價(jià) 吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原酶、氨基脫羧酶活性、D-乳酸檢測(cè)參考文獻(xiàn)[10]中報(bào)道的方法。

1.2.2.3 菌株動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)

1）受試菌液的制備 將試驗(yàn)菌株按3%的接種量接于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，8 000 r/min，離心10 min，棄上清液，加入無(wú)菌生理鹽水，將菌體細(xì)胞洗滌2 次，調(diào)OD 值，使菌液濃度為1010CFU/mL 和108CFU/mL。

2）急性毒性實(shí)驗(yàn) 將健康昆明小白鼠，分為4 組，每組12 只，雌雄各半，分別是對(duì)照組、植物乳桿菌172 組、植物乳桿菌173 組、發(fā)酵乳桿菌179 組。對(duì)照組灌胃0.85%的無(wú)菌生理鹽水，乳酸菌試驗(yàn)組灌胃受試菌液，灌胃濃度為1010CFU/mL，劑量為0.5 mL/d。灌胃前1 d 小鼠禁食16 h，

不限飲水。灌胃后1，3，5，7 d 記錄小鼠體重變化，一般表現(xiàn)、行為及中毒表現(xiàn)。一般表現(xiàn)、行為及中毒表現(xiàn)主要包括：行為、動(dòng)作、各種刺激反應(yīng)、瞳孔大小、鼻孔、呼吸、糞便硬度、糞便顏色、皮毛、眼球、姿勢(shì)等。

3）30 d 喂養(yǎng)試驗(yàn) 將健康昆明小白鼠分為7 組，每組8 只，雌雄各半，分別是對(duì)照組（灌胃0.85%的無(wú)菌生理鹽水）、植物乳桿菌172-1010組，植物乳桿菌172-108組（灌胃的受試菌液濃度分別為1010CFU/mL 和108CFU/mL，灌胃劑量為0.2 mL/d）、植物乳桿菌173-1010組、植物乳桿菌173-108組和發(fā)酵乳桿菌179-1010組、發(fā)酵乳桿菌179-108組。連續(xù)灌胃30 d，每天灌胃1 次，每天灌胃時(shí)間相同。

表1 乳酸菌菌株的毒力基因、產(chǎn)生物胺基因及耐藥基因的PCR 引物Table 1 Primer sequences of virulence factors，biogenic amine producing and antimicrobial resistance genes of lactic acid bacteria

每天記錄小鼠的一般表現(xiàn)、行為、中毒表現(xiàn)和死亡情況。每周稱1 次體重。將上述小鼠在第31天于無(wú)菌環(huán)境下解剖，在無(wú)菌范圍內(nèi)用滅菌的手術(shù)刀將各個(gè)臟器切開(kāi)，用無(wú)菌棉簽擦拭臟器剖面，涂布于MRS 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)；將各個(gè)臟器在無(wú)菌范圍內(nèi)制備成組織抹片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，觀察有無(wú)細(xì)菌易位現(xiàn)象。

對(duì)肝、腎、脾、心、肺稱重，制作石蠟切片，進(jìn)行組織染色觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

分離自山西老陳醋醋醅中的20 株乳酸菌的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1所示。其中5 株植物乳桿菌 （L.plantarum），5 株發(fā)酵乳桿菌 （L.fermenti），3 株戊糖片球菌（P.pentosaceu），2 株淀粉乳桿菌（L.amylovorus），3 株短乳桿菌（L.brevis）和2 株干酪乳桿菌（L.casei）。

圖1 基于16S rDNA 序列的20 株乳酸菌進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Dendrogram of LAB isolates based on 16S rDNA sequence

2.2 菌株的益生特性

本試驗(yàn)對(duì)分離自山西老陳醋醋醅中的20 株乳酸菌菌株的耐酸、耐膽鹽特性，DPPH、膽固醇的清除能力，ACE 抑制活性，生物胺降解能力及產(chǎn)細(xì)菌素、γ-氨基丁酸和乙偶姻等益生特性進(jìn)行研究，以期擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。益生菌必須對(duì)人體消化系統(tǒng)分泌的胃液、膽汁和胰液等消化液具有一定的耐受性。由表2可知，20 株乳酸菌菌株都表現(xiàn)出一定的酸和膽鹽耐受性，其中，植物乳桿菌171，172，173，175 和發(fā)酵乳桿菌178，179 的耐受性強(qiáng)于其它菌株，在模擬胃液（pH 2.0+0.1%胃蛋白酶）和模擬腸液（pH 7.0+0.1%牛膽鹽）中分別消化2 h 和24 h 后，活菌數(shù)仍然保持在106CFU/mL 左右。并且植物乳桿菌172，173 和發(fā)酵乳桿菌179 這3 株菌在后續(xù)篩選試驗(yàn)中都呈現(xiàn)出良好的益生特性，具有較高的DPPH（65.35%，68.12%，60.38%）、膽固醇的清除能力（55.56%，60.52%，57.81%），血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制（ACEI）活性（83.12%，80.05%，79.35%），生物胺降解能力（68.52%，60.32%，52.00%）及產(chǎn)細(xì)菌素（12800，12800，6400 AU/mL）、γ-氨基丁酸（0.92，1.03，0.99 g/L）和乙偶姻（0.35，0.52，0.37 g/L）的能力。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分醋源乳酸菌的耐酸特性都較強(qiáng)，尤其是植物乳桿菌，這與種屬（植物乳桿菌的基因組通常較大，為3.35 Mb，而其它乳酸菌菌株的基因組為1.8～3.2 Mb，基因組大則可能含有的代謝及耐受基因數(shù)量多，表現(xiàn)出對(duì)外界不良環(huán)境適應(yīng)性和抵抗性較其它菌屬?gòu)?qiáng)） 和所處的釀醋環(huán)境（醋醅pH 值為3 左右）對(duì)菌株的馴化作用有關(guān)。

老陳醋釀造的前期是酒精發(fā)酵，特別是在蘋(píng)果酸、乳酸發(fā)酵這一步，由于微生物（大部分酵母菌和一些細(xì)菌） 氨基酸脫羧酶的作用產(chǎn)生大量生物胺，經(jīng)醋酸發(fā)酵后，使得生物胺的含量有所降低（具有降解生物胺能力的乳酸菌和醋酸菌）[11]，然而仍有部分生物胺殘留在最終的醋產(chǎn)品中，引起食品安全隱患。很多學(xué)者致力于研究具有降解生物胺能力的乳酸菌的篩選，并成功地應(yīng)用于發(fā)酵酒類、泡菜、肉制品生產(chǎn)中[12-13]，而鮮有關(guān)于醋源降生物胺乳酸菌的篩選及強(qiáng)化應(yīng)用在陳醋生產(chǎn)中的相關(guān)報(bào)道。

乳酸菌細(xì)菌素，作為一種抑菌蛋白，成為近年來(lái)乳酸菌界的研究熱點(diǎn)。乳酸菌作為老陳醋生產(chǎn)過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌屬，除了具有產(chǎn)酸、協(xié)調(diào)香氣、平衡風(fēng)味等重要作用，抑制有害雜菌是其另一重要功能，尤其在漫長(zhǎng)的大曲制備（1 個(gè)月）、成熟過(guò)程中（3～6 個(gè)月），抑制雜菌生長(zhǎng)、繁殖，保證主要功能菌群如霉菌、酵母菌和乳酸菌作為優(yōu)勢(shì)菌。將產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌菌株應(yīng)用到大曲制備中，對(duì)保證、提高成品曲的質(zhì)量，降低食品安全風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

川芎嗪，具有多種生物和藥理活性，被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、腎病、兒科疾病等病癥的臨床治療，是山西老陳醋的特征功效成分。乙偶姻是生成川芎嗪的重要前體物質(zhì)，陳醋發(fā)酵過(guò)程中乙偶姻形成的代謝途徑和影響因素非常復(fù)雜，其中涉及到的主要菌種有酵母菌、乳酸菌、醋酸菌和芽孢菌[14-15]。本文主要對(duì)老陳醋生產(chǎn)中高產(chǎn)乙偶姻的乳酸菌進(jìn)行篩選，為今后將其強(qiáng)化應(yīng)用在功能食醋產(chǎn)品開(kāi)發(fā)上提供基礎(chǔ)研究。

氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）是山西老陳醋中又一重要潛在功能因子，具有改善神經(jīng)功能、腦機(jī)能，抗癌，抗心律失常，健肝利腎等多種功效，已成為一種新型活性因子，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥與食品領(lǐng)域并成為研究熱點(diǎn)。乳酸菌以谷氨酸或其鹽類為底物通過(guò)谷氨酸脫羧酶對(duì)底物進(jìn)行脫羧從而合成GABA，是GABA 重要的生物合成方式，已經(jīng)將其應(yīng)用在功能酸奶、干酪、飲料、面包上，然而未見(jiàn)其應(yīng)用在生產(chǎn)高附加值功能醋產(chǎn)品的報(bào)道。老陳醋以高粱、大麥等谷物為主要的生產(chǎn)原料，研究報(bào)道采用乳酸菌發(fā)酵谷物會(huì)產(chǎn)生大量GABA，這就使食醋作為富含GABA 的功能載體，與其它產(chǎn)品形式相比，具有不用額外添加底物谷氨酸鹽、輔酶磷酸吡哆醛、谷氨酸脫羧酶等優(yōu)勢(shì)，體現(xiàn)出良好的研究應(yīng)用價(jià)值。

2.3 菌株的安全評(píng)價(jià)

近年來(lái)，乳酸菌安全性問(wèn)題得到廣泛關(guān)注，傳統(tǒng)乳酸菌由于悠久的食用歷史，一直被認(rèn)為是安全的（GRAS）。然而，有研究表明能夠從一些患者體內(nèi)分離出乳酸菌，可能與菌血癥、心內(nèi)膜炎、尿道感染等疾病有關(guān)。由于毒性及感染性因子具有菌株特異性，因此，對(duì)于新的具有潛在益生作用的乳酸菌菌株都必須進(jìn)行安全評(píng)價(jià)。本文主要從毒力因子、耐藥性、有害代謝產(chǎn)物產(chǎn)生及體內(nèi)毒理實(shí)驗(yàn)等方面，對(duì)20 株醋源乳酸菌菌株進(jìn)行了較系統(tǒng)的安全評(píng)價(jià)。

2.3.1 菌株的體外安全評(píng)價(jià) 根據(jù)國(guó)際上關(guān)于乳酸菌安全評(píng)價(jià)體系的內(nèi)容，毒力因子的檢測(cè)非常必要，因?yàn)檫@些基因經(jīng)常位于結(jié)合性質(zhì)粒上，益生乳酸菌中攜帶的毒力基因可能來(lái)自于其它致病菌，如某些腸球菌，也可能水平轉(zhuǎn)移到其它菌種中，造成食品安全隱患。

asa1（聚合物，Aggregation substance）、esp（腸球菌表面蛋白，Enterococcal surface protein）和ace（黏附膠原，Adhesion of collagen）屬于黏附型毒力因子。聚合物的定植作用是致病菌感染宿主細(xì)胞最為關(guān)鍵的一步，有了這種黏附作用，腸球菌不僅可以調(diào)節(jié)自身的聚集也能促進(jìn)腸球菌在宿主細(xì)胞上的定植，便于腸球菌感染宿主細(xì)胞[16]。gelE（ 明 膠 酶，Gelatinase）、hyl （ 透 明 質(zhì) 酸 酶，Haluronidase）、cylA（細(xì)胞溶素，Cytolisin）屬于分泌型毒力因子。編碼明膠酶的基因gel 位于染色體上，約為1 520 bp，明膠酶不僅參與生物膜的形成過(guò)程，也降解宿主體內(nèi)的膠原蛋白、纖維蛋白、抗菌肽和補(bǔ)體等，使機(jī)體的免疫系統(tǒng)遭到破壞，也可使腸球菌擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移至體內(nèi)其它位置，增加感染幾率[17]。細(xì)胞溶素（Cytolisin），又名β-溶血素（βhemolysin），是革蘭氏陽(yáng)性菌所產(chǎn)生的一類二肽物質(zhì)，對(duì)原核生物和真核生物都能產(chǎn)生毒害作用，細(xì)胞溶素在動(dòng)物體內(nèi)的致病作用已有相關(guān)報(bào)道[18]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞溶素基因和聚合物基因通常位于同一個(gè)質(zhì)粒上[19]，因此，腸球菌在合成細(xì)胞溶素的同時(shí)，也往往能夠生成聚合物。表3結(jié)果顯示，僅在2 株乳酸菌中檢測(cè)出hyl 基因，分別是植物乳桿菌175 和發(fā)酵乳桿菌180，另外一株戊糖片球菌183和干酪乳桿菌189 顯示出ace 陽(yáng)性，其它毒力基因均未被檢出。

抗藥性是乳酸菌安全評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容。由于抗生素的不當(dāng)使用，越來(lái)越多的乳酸菌具有耐藥性，或者攜帶耐藥基因，大部分耐藥基因位于可移動(dòng)的非染色體遺傳因子上，可通過(guò)水平轉(zhuǎn)移進(jìn)而傳遞給其它腸道菌株，甚至是致病菌中，導(dǎo)致超級(jí)耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生，給人類的健康帶來(lái)嚴(yán)重危害。為初步探究乳酸菌的耐藥機(jī)制，本文檢測(cè)了大環(huán)內(nèi)酯-林肯酰胺類（ermB，lnuA）及四環(huán)素類（tetM）、氨基糖苷類 （aac （6′）-aph （2″））、β-內(nèi)酰胺類（blaZ）、和萬(wàn)古霉素（vanX）等抗生素耐性基因在20 株醋源乳酸菌中的分布情況。表3結(jié)果顯示，ermB 和tetM 的檢測(cè)率較高，分別達(dá)到70%（14/20） 和65%（13/20），2 株淀粉乳桿菌顯示出blaZ和vanX 呈陽(yáng)性，另外還有2 株干酪乳桿菌189、190 包含以上檢測(cè)的所有耐藥基因，為多重耐藥菌株。目前，關(guān)于乳酸菌的耐藥性研究主要集中在動(dòng)物源、乳及乳制品中的分離菌株，鮮有關(guān)于傳統(tǒng)發(fā)酵食品如發(fā)酵肉類、泡菜、醋中乳酸菌的耐藥性研究報(bào)道[20]。本文研究結(jié)果顯示醋源乳酸菌的耐藥性可能成為食品安全隱患，除了加強(qiáng)禁止抗生素濫用規(guī)定外，應(yīng)重視傳統(tǒng)發(fā)酵食品菌株的安全評(píng)價(jià)，今后需對(duì)耐藥質(zhì)粒檢測(cè)，轉(zhuǎn)移機(jī)制、途徑等作進(jìn)一步系統(tǒng)研究。

有害代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生是乳酸菌安全評(píng)價(jià)的又一重要內(nèi)容，包括氨基脫羧酶活性、硝酸鹽還原酶活性吲哚試驗(yàn)及D-乳酸生成等。一些乳酸菌具有氨基酸脫羧酶活性，它們能夠?qū)⑹称分械陌被崦擊冗€原成生物胺類物質(zhì)，若胺類物質(zhì)在體內(nèi)積累過(guò)多，則會(huì)引起中毒癥狀。

如表3所示，7 株菌中含有編碼酪氨酸脫羧酶的tdc 基因，5 株菌含有odc （鳥(niǎo)氨酸脫羧酶）基因，并未檢測(cè)出hdc（組氨酸脫羧酶）基因。并且在大多數(shù)陽(yáng)性菌株中，含有tdc 基因的菌株同時(shí)攜帶odc 基因，如植物乳桿菌175 和3 株短乳桿菌186，187，188，這與欒同青[21]對(duì)黃酒釀造過(guò)程中分離的乳酸菌的檢測(cè)結(jié)果相似。試驗(yàn)還進(jìn)一步采用脫羧酶培養(yǎng)基檢測(cè)了菌株產(chǎn)生物胺的表型情況，試驗(yàn)結(jié)果與PCR 結(jié)論一致（數(shù)據(jù)未給出）。孟甜[22]對(duì)26 株乳酸菌的檢測(cè)結(jié)果顯示其中6 株菌基因顯示陽(yáng)性，而表型卻顯示陰性。脫羧酶培養(yǎng)基中加入了氨基酸前體物質(zhì)，可以專一性的檢測(cè)到不同脫羧酶的活力，然而該方法易受外界因素的影響，如顯色劑、葡萄糖濃度、誘導(dǎo)劑、pH 值、氯化鈉濃度、氧氣等，也可能出現(xiàn)基因突變或基因“沉默”現(xiàn)象。報(bào)道稱產(chǎn)生物胺的乳酸菌分布在不同的種屬間，然而并無(wú)種屬特異性，因此必須對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品來(lái)源乳酸菌進(jìn)行生物胺相關(guān)檢測(cè)，確保其安全使用。

硝酸鹽還原酶可以將食物中含有的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽可與食品中蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的中間產(chǎn)物仲胺反應(yīng)形成亞硝胺，亞硝胺可誘發(fā)多種癌癥。過(guò)量攝入D-乳酸或DL-乳酸則有可能引起代謝紊亂，甚至導(dǎo)致中毒。本試驗(yàn)中所有菌株吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原酶、D-乳酸試驗(yàn)均為陰性。

表2 食醋來(lái)源乳酸菌菌株的益生特性Table 2 Probiotic character of LAB isolates from Shanxi aged vinegar

表3 食醋來(lái)源乳酸菌菌株的體外安全性評(píng)價(jià)Table 3 Safety assessment in vitro of LAB isolates from Shanxi aged vinegar

2.3.2 菌株的體內(nèi)安全評(píng)價(jià)

2.3.2.1 急性毒性試驗(yàn) 在毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，受試動(dòng)物的體重變化是機(jī)體各器官、系統(tǒng)發(fā)育狀況的總和，是反應(yīng)受試物對(duì)機(jī)體影響的一項(xiàng)綜合性指標(biāo)，可以作為評(píng)價(jià)受試物對(duì)機(jī)體影響的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本試驗(yàn)以1010CFU/mL 的濃度分別灌胃小鼠，觀察7 d，各組小鼠生長(zhǎng)、行為和精神狀況良好，皮毛整潔光澤，飲食、糞便等均正常，未見(jiàn)明顯的中毒癥狀，無(wú)死亡。各組體重增加趨勢(shì)如圖2所示，各試驗(yàn)組小鼠體重增長(zhǎng)趨勢(shì)正常，7 d 平均體重增長(zhǎng)3.7～4.8 g，灌胃不同試驗(yàn)菌液的試驗(yàn)組小鼠體重與對(duì)照組相比，均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

2.3.2.2 30 d 喂養(yǎng)試驗(yàn) 3 株試驗(yàn)菌株的高劑量（1010CFU/mL）和低劑量（108CFU/mL）分別灌胃實(shí)驗(yàn)小鼠30 d，各組小鼠的一般表現(xiàn)、行為和精神狀況良好，攝食、飲水、排泄正常，未見(jiàn)明顯的中毒表現(xiàn)，無(wú)死亡。體重增長(zhǎng)正常，如圖3所示，試驗(yàn)菌株各劑量組小鼠第1 周到第2 周平均體重增長(zhǎng)3.6～5.3 g，以后每周體重增加趨于穩(wěn)定，每周平均體重增長(zhǎng)1～2.5 g，各劑量組小鼠30 d 平均體重增長(zhǎng)8～11 g。經(jīng)方差顯著性分析，均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。在關(guān)于乳酸菌對(duì)小鼠體重影響的研究中[23-24]，體重升高和降低皆有報(bào)道，可能與菌株特異性（某些乳酸菌具有減肥功效，而乳酸菌也具有促進(jìn)食欲，幫助消化，營(yíng)養(yǎng)吸收，增加體重的功能）及灌胃劑量、試驗(yàn)周期有關(guān)。

圖2 急性毒性試驗(yàn)中菌株對(duì)小鼠體重的影響Fig.2 The weight growth trends of mice for acute toxicity test （7 days）

臟器指數(shù)是各臟器與體重的一個(gè)比值，是毒理實(shí)驗(yàn)中常用的指標(biāo)，正常時(shí)比較恒定，當(dāng)毒性反應(yīng)發(fā)生后，受損臟器質(zhì)量可以發(fā)生相應(yīng)改變，故臟器指數(shù)也隨之改變。當(dāng)臟器充血、水腫或增生肥大時(shí)，臟器指數(shù)增大。臟器萎縮及其它退行性病變時(shí)，臟器指數(shù)減小。30 d 喂養(yǎng)結(jié)束后對(duì)小鼠進(jìn)行大體解剖，各組織器官正常，未見(jiàn)器質(zhì)性病變，各臟器顏色正常，質(zhì)軟，無(wú)腫塊。各試驗(yàn)菌株對(duì)各組織器官的影響見(jiàn)表4和圖4所示，3 株試驗(yàn)菌株及生理鹽水對(duì)照組的各試驗(yàn)組小鼠的腎體比、脾體比、肺體比、肝體比、心體比與對(duì)照組小鼠相比，均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

由圖4可以看出，各組小鼠肝臟、腎臟、脾臟無(wú)異常變化。鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞無(wú)腫脹，肝小葉界限清楚，血竇內(nèi)無(wú)充血現(xiàn)象，無(wú)異常細(xì)胞出現(xiàn)。鏡下可見(jiàn)腎小體毛細(xì)血管無(wú)異常改變，管壁細(xì)胞無(wú)腫脹，巧窠界限清晰。遠(yuǎn)曲小管、近曲小管邊界清楚。髓質(zhì)區(qū)各種小管整齊排列、分布。脾臟組織結(jié)構(gòu)清晰，紅、白髓界限分明，白髓成熟淋巴細(xì)胞豐富，內(nèi)含較多淋巴小結(jié)，脾索和脾竇排列整齊。綜上可見(jiàn)，肝臟、腎臟、脾臟均無(wú)任何特異性病理改變，說(shuō)明灌胃試驗(yàn)菌株對(duì)小鼠各組織器官無(wú)影響。

細(xì)菌易位是指原存在于腸腔內(nèi)的細(xì)菌過(guò)度繁殖，在腸黏膜屏障損害和機(jī)體免疫防御功能低下等情況下，通過(guò)某種途徑越過(guò)腸黏膜屏障，進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)、門(mén)靜脈系統(tǒng)，繼而進(jìn)入體循環(huán)以及肝、脾、肺等遠(yuǎn)隔器官的過(guò)程，從而激發(fā)全身性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致膿毒癥，多臟器功能不全，甚至多臟器功能衰竭[25]。本文采用涂布的MRS 固體培養(yǎng)基和細(xì)菌抹片經(jīng)革蘭氏染色鏡檢方法，考察3 株菌的易位情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各個(gè)器官中均未見(jiàn)乳酸菌的生長(zhǎng)，故無(wú)細(xì)菌易位現(xiàn)象發(fā)生。然而在腸道疾病或免疫力低下等情況下，是否會(huì)發(fā)生細(xì)菌易位，還有待進(jìn)一步研究。

圖3 30 d 喂養(yǎng)試驗(yàn)中菌株對(duì)小鼠體重的影響Fig.3 The weight growth trends of mice for toxicity test （30 days）

表4 30 d 喂養(yǎng)試驗(yàn)試驗(yàn)菌株對(duì)小鼠臟器的影響Table 4 The internal organ indices of mice for toxicity test （30 days）

圖4 30 d 喂養(yǎng)試驗(yàn)小鼠臟器組織切片F(xiàn)ig.4 The organs tissue sections of mice for toxicity test （30 days）

3 結(jié)論

本文主要對(duì)20 株分離自山西老陳醋醅中的乳酸菌菌株進(jìn)行了DPPH、膽固醇清除、生物胺降解、ACE 抑制等益生活性及產(chǎn)細(xì)菌素、γ-氨基丁酸和乙偶姻等功能活性代謝產(chǎn)物能力篩選，從中篩選出3 株優(yōu)良益生乳酸菌菌株：植物乳桿菌172，173 和發(fā)酵乳桿菌179。體外安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)及小鼠毒理實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了這3 株菌的安全性，為將其開(kāi)發(fā)成益生菌制劑提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。另外，試驗(yàn)結(jié)果還表明，這20 株分離自醋醅的乳酸菌菌株中，耐藥基因ermB 和tetM 的陽(yáng)性率達(dá)到65%以上；部分菌株攜帶氨基酸脫羧酶基因；還有少量菌株含有hyl、ace 等毒力基因，因此對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品來(lái)源的乳酸菌菌株作安全評(píng)價(jià)十分必要。