張一平，張 倩，王一然，宮曉菲，任雅麗，夏學(xué)軍 ，劉玉玲

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所·藥物傳輸技術(shù)及新型制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050；2.世貿(mào)天階制藥＜江蘇＞有限責(zé)任公司，江蘇 鹽城224100）

鹽酸二甲雙胍因療效可靠、安全性好，已成為治療 2型糖尿病的首選藥物。鹽酸二甲雙胍緩釋片可使血藥濃度更平穩(wěn)，胃腸道不良反應(yīng)降低，服藥次數(shù)減少[1－2]，具有更好的臨床使用價(jià)值及市場開發(fā)前景。自2016年全面開展仿制藥一致性評價(jià)以來，我國對于仿制藥的研究內(nèi)容更明確和嚴(yán)格。鹽酸二甲雙胍緩釋片屬批準(zhǔn)較早的仿制藥，嚴(yán)格把控其質(zhì)量十分必要。二甲胺是鹽酸二甲雙胍合成反應(yīng)過程中的起始原料[3]，近距離接觸對眼和呼吸道有強(qiáng)烈的刺激作用，危害人體健康，因此有必要對鹽酸二甲雙胍中的二甲胺進(jìn)行質(zhì)量控制。各國藥典收錄的鹽酸二甲雙胍及其制劑中，僅有《歐洲藥典（9.0版）》[4]規(guī)定了鹽酸二甲雙胍中二甲胺（標(biāo)記為雜質(zhì)F）的檢查方法及限度（供試品的0.05%）；《美國藥典》[5]收錄有鹽酸二甲雙胍緩釋片，未規(guī)定二甲胺的檢查。李慧敏等[6]報(bào)道了測定鹽酸二甲雙胍中二甲胺殘留的離子色譜－直接電導(dǎo)法，反應(yīng)條件苛刻，試驗(yàn)對儀器要求較高。馮超等[7]使用氯甲酸－9－芴甲酯為衍生化試劑，建立了測定鹽酸二甲雙胍原料中二甲胺含量的柱前衍生化高效液相色譜（HPLC）法，衍生化過程煩瑣復(fù)雜，操作不便。本研究中參考《歐洲藥典（9.0版）》鹽酸二甲雙胍標(biāo)準(zhǔn)中雜質(zhì)F檢查法，通過優(yōu)化色譜條件及供試品配制方法，建立了一種靈敏度高、易操作的測定鹽酸二甲雙胍緩釋片中二甲胺含量的柱前衍生化HPLC法，并對原研和自制得到的2種鹽酸二甲雙胍緩釋片穩(wěn)定性試驗(yàn)樣品中二甲胺的含量進(jìn)行了考察?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；XS105DU型電子分析天平（梅特勒－托利多公司，精度為十萬分之一）；KQ－50B型超聲波清洗機(jī)（昆明市超聲儀器有限公司，功率為50 W，頻率為40 kHz）；JR－2型集熱式磁力加熱攪拌器（天津歐諾儀器有限公司）。

1.2 試藥

二甲胺標(biāo)準(zhǔn)品（European Directorate for the Quality Medicines＆Healthcare，批號為00YIB6）；2，4－二硝基氟苯（東京化成工業(yè)株式會社，批號為YX25N－PJ）；三乙胺（Aladdin Industrial Corporation，批號為H1718084）；鹽酸二甲雙胍(山東科源制藥股份有限公司，批號為P510－1809023)；鹽酸二甲雙胍緩釋片(商品名Glucophage XR，Bristol－Myers Squibb，編號分別為1，2）；自制鹽酸二甲雙胍緩釋片（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，編號分別為1，2，3）；甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸、氫氧化鈉、鹽酸、過氧化氫均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilient XDB C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.1%磷酸溶液（A）－乙腈（B），梯度洗脫，洗脫程序見表1；流速：1.2 mL／min；檢測波長：380 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5μL。

表1 流動相洗脫程序

2.2 溶液制備

衍生試劑：精密量取1 mL2，4－二硝基氟苯，置100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，臨用現(xiàn)配。

對照品溶液：精密量取二甲胺標(biāo)準(zhǔn)品1 mL，置100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液2.5 mL，置100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為二甲胺對照品貯備溶液。精密量取二甲胺對照品貯備溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇7 mL，加入100μL三乙胺和1mL衍生試劑，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，于60℃水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，即得。

供試品溶液：取鹽酸二甲雙胍緩釋片粉末適量（約相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍10 mg），精密稱定，置10 mL容量瓶中，加8 mL甲醇，超聲20 min后，加入100μL三乙胺和1 mL衍生試劑，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，于60℃水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

原料藥溶液：取鹽酸二甲雙胍原料藥10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇8 mL，超聲20 min后，加入100μL三乙胺和1 mL衍生試劑，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，于60℃水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

空白輔料溶液：取空白輔料10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇8 mL，超聲20 min后，加入100μL三乙胺和1 mL衍生試劑，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，于60℃水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 測定方法及反應(yīng)原理

測定方法：分別取5μL供試品溶液及對照品溶液注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以對照品溶液質(zhì)量濃度為限度（0.05%），采用外標(biāo)法計(jì)算含量。

反應(yīng)原理：2，4－二硝基氟苯是一種反應(yīng)活性高、價(jià)廉的衍生劑，其與氨基反應(yīng)迅速、結(jié)合牢固，衍生產(chǎn)物具有紫外吸收特性且相當(dāng)穩(wěn)定，是進(jìn)行柱前衍生反應(yīng)的理想試劑[8]?；瘜W(xué)反應(yīng)方程式見圖1。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn)

1)二甲胺定位及干擾試驗(yàn)

取空白溶劑、空白輔料溶液和對照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見圖2。在此色譜條件下，二甲胺衍生物峰形良好，保留時(shí)間為5.6 min，空白溶劑及輔料對主峰的測定無干擾。

圖1 衍生化反應(yīng)方程式

圖2 高效液相色譜圖

2)破壞試驗(yàn)

光照破壞：分別取原研制劑和自制鹽酸二甲雙胍緩釋片細(xì)粉適量，置適當(dāng)容器中平鋪，于4 500 lx照度下照射24 h，取出，分別取相當(dāng)于原料藥10 mg的緩釋片細(xì)粉，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖4 A。結(jié)果表明，與初始條件（見圖3）相比，光照條件下原研制劑與自制鹽酸二甲雙胍緩釋片的二甲胺含量均未明顯增加。

圖3 初始條件下的高效液相色譜圖

中高溫破壞：分別取原研制劑和自制鹽酸二甲雙胍緩釋片細(xì)粉適量，置適當(dāng)容器中平鋪，于100℃烘箱中放置24 h，取出，分別取相當(dāng)于原料藥10 mg的緩釋片細(xì)粉，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖4 B。結(jié)果表明，與初始條件（圖3）相比，高溫條件下原研制劑與自制鹽酸二甲雙胍緩釋片的二甲胺含量均明顯增加。

高溫破壞：分別取原研制劑和自制鹽酸二甲雙胍緩釋片細(xì)粉適量，置適當(dāng)容器中平鋪，于220℃馬弗爐中放置3 min，取出，分別取相當(dāng)于原料藥10 mg的緩釋片細(xì)粉，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖4 C。結(jié)果表明，與初始條件（圖3）相比，高溫條件下原研制劑與自制鹽酸二甲雙胍緩釋片的二甲胺含量均明顯增加。

氧化破壞試驗(yàn)：取原研制劑和自制鹽酸二甲雙胍緩釋片粉末適量（約相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍10 mg），精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇6 mL，超聲20 min，再加30% H2O2溶液1 mL，搖勻，放置24 h，加100μL三乙胺和1 mL衍生試劑，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，于60℃水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，搖勻，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖4 D。結(jié)果表明，與初始條件（圖3）相比，氧化條件下原研制劑與自制鹽酸二甲雙胍緩釋片的二甲胺含量均未明顯增加。

強(qiáng)酸破壞試驗(yàn)：取原研制劑和自制鹽酸二甲雙胍緩釋片粉末適量（相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍10 mg），精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇5 mL，超聲20 min，再加1 mol／L鹽酸溶液1 mL，搖勻，放置24 h，加1 mol／L氫氧化鈉溶液1 mL中和鹽酸，搖勻，加100μL三乙胺和1 mL衍生試劑，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，于60℃水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖4 E。結(jié)果表明，與初始條件（圖3）相比，強(qiáng)酸條件下原研制劑與自制鹽酸二甲雙胍緩釋片的二甲胺含量均明顯增加。

強(qiáng)堿破壞試驗(yàn)：取原研制劑和自制鹽酸二甲雙胍緩釋片粉末適量（約相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍10 mg），精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇5 mL，超聲20 min，再加1 mol／L氫氧化鈉溶液1 mL，搖勻，放置24 h，加1 mol／L鹽酸溶液1 mL中和氫氧化鈉，搖勻，加100μL三乙胺和1 mL衍生試劑，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，于60℃水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖4 F。結(jié)果表明，與初始條件(圖3)相比，強(qiáng)堿條件下原研制劑與自制鹽酸二甲雙胍緩釋片的二甲胺含量均明顯增加。

圖4 破壞試驗(yàn)下的高效液相色譜圖

2.4.2 檢測限與定量限確定

精密量取二甲胺對照溶液適量，用甲醇定量稀釋制成系列不同質(zhì)量濃度的溶液，衍生化反應(yīng)后，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，信噪比（S／N）＝3計(jì)為檢測限，S／N＝10計(jì)為定量限。結(jié)果該法檢測限以二甲胺計(jì)為4.59 ng／mL，定量限為17.80 ng／mL。

2.4.3 線性關(guān)系考察及精密度試驗(yàn)

取二甲胺對照品貯備溶液依次稀釋，獲得二甲胺質(zhì)量濃度分別為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6μg／mL的系列對照品溶液，依法制備對照品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（C，μg／mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A＝70.29 C－0.93，r＝0.999 1(n＝5)。結(jié)果表明，二甲胺質(zhì)量濃度在0.2～0.6μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。取經(jīng)衍生化后的對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.5μg／mL)，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.22%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

依法平行制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，6份供試品溶液中二甲胺的含量均基本一致，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn)

取鹽酸二甲雙胍緩釋片粉末適量（約相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍10 mg），精密稱定，共9份，置10 mL容量瓶中，分別加入甲醇8 mL，超聲20 min，每個(gè)容量瓶中依次加入相當(dāng)于對照品溶液質(zhì)量濃度80%，100%，120%的對照品溶液各1 mL，每個(gè)質(zhì)量濃度各3份，分別加100μL三乙胺和1 mL衍生試劑，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，60℃水浴加熱30 min，取出，冷卻至室溫，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為98.00%，RSD為1.37%（n＝9），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取供試品溶液及對照品溶液各5μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，分別于0，2，4，6，8，10 h時(shí)進(jìn)樣分析。結(jié)果在室溫放置10 h內(nèi)，供試品溶液和對照品溶液中二甲胺的峰面積均無明顯變化，表明溶液穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品含量測定

取2批原研緩釋片和3批自制緩釋片初始、加速試驗(yàn)6個(gè)月[溫度（40±2）℃，相對濕度(75±5)%]及長期試驗(yàn)24個(gè)月[溫度（25±2）℃，相對濕度(60±10)%]條件樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，按外標(biāo)法以標(biāo)示量計(jì)算樣品中二甲胺含量。詳見表2。結(jié)果表明，加速試驗(yàn)6個(gè)月和長期試驗(yàn)24個(gè)月放置條件下鹽酸二甲雙胍緩釋片的二甲胺含量與初始均無明顯變化。

表2 樣品中二甲胺含量測定結(jié)果(%)

3 討論

本研究中參考《歐洲藥典》（EP9.0）鹽酸二甲雙胍原料藥中雜質(zhì)F（二甲胺）的柱前衍生化測定法，并采用與以上標(biāo)準(zhǔn)一致的色譜條件，包括檢測器、檢測波長、柱溫、進(jìn)樣量及色譜柱填料等，僅色譜柱規(guī)格與《歐洲藥典》中有所不同。《歐洲藥典》采用的色譜柱規(guī)格為(125 mm×3 mm，5μm)，本研究中所用色譜柱規(guī)格為(150 mm×4.6 mm，5μm)，故根據(jù)公式(流速＝內(nèi)徑之比2×原流速，時(shí)間＝柱長之比×原時(shí)間)進(jìn)行計(jì)算，對色譜條件中流速和梯度洗脫時(shí)間進(jìn)行了調(diào)整。供試品溶液配制過程中，取鹽酸二甲雙胍原料藥，按2.2項(xiàng)下原料藥溶液制備方法分別采用甲醇和乙腈進(jìn)行配制，對提取溶劑進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，鹽酸二甲雙胍在甲醇中能完全溶解，而在乙腈中溶解度不足80%，故選擇對鹽酸二甲雙胍有更好溶解效果的甲醇作為溶劑，以保證鹽酸二甲雙胍中的二甲胺提取完全。

本研究結(jié)果顯示，原研和自制鹽酸二甲雙胍緩釋片的二甲胺含量均小于0.05%，在《歐洲藥典》規(guī)定限度之內(nèi)，認(rèn)為全部符合要求。同時(shí)，通過對二者的專屬性和穩(wěn)定性進(jìn)行考察，結(jié)果表明，二者專屬性規(guī)律一致，且在加速試驗(yàn)6個(gè)月和長期試驗(yàn)24個(gè)月條件下均穩(wěn)定，故認(rèn)為自制制劑與參比制劑有較好的一致性；鹽酸二甲雙胍緩釋片在高溫、強(qiáng)酸和強(qiáng)堿破壞條件下均降解產(chǎn)生二甲胺，故判定二甲胺為鹽酸二甲雙胍降解產(chǎn)物之一。因此，在制備及貯存鹽酸二甲雙胍緩釋片時(shí)需注意避免高溫條件、強(qiáng)酸性及強(qiáng)堿性環(huán)境；二甲胺既是鹽酸二甲雙胍的合成中間體，也是其降解產(chǎn)物，故有必要對鹽酸二甲雙胍原料中二甲胺含量進(jìn)行嚴(yán)格控制。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，二甲胺含量與初始試驗(yàn)相等，鹽酸二甲雙胍緩釋片加速試驗(yàn)6個(gè)月和長期試驗(yàn)24個(gè)月的樣品無明顯變化，質(zhì)量穩(wěn)定。因此，在制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只要保證鹽酸二甲雙胍原料中二甲胺的含量控制即可，不需將二甲胺限度制訂入緩釋片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，該方法能準(zhǔn)確地測定鹽酸二甲雙胍緩釋片的二甲胺含量，方法簡便，靈敏度高，重復(fù)性好，可用于鹽酸二甲雙胍緩釋片的質(zhì)量控制。