徐書琴，胡靜怡，張恒維，趙浩東，劉 鵬，席毓淋，李 谞，張 顯*，饒志明

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

L-天冬酰胺酶能夠通過水解脫氨基反應(yīng)，將L-天冬酰胺催化形成L-天冬氨酸和氨[1]。目前E.coli、Erwinia chrysanthemi及Erwinia carotovora等微生物來源的L-天冬酰胺酶已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于治療多種疾病，如急性淋巴白血病和淋巴肉瘤等[2]。但是，該酶的半衰期短、酶活性低、具有副催化反應(yīng)等缺陷導(dǎo)致在臨床應(yīng)用時(shí)會(huì)出現(xiàn)一些較嚴(yán)重不適應(yīng)性。

此外，有研究表明，L-天冬酰胺酶除了在醫(yī)藥方面有非常廣泛的應(yīng)用，其在食品行業(yè)也有較好的應(yīng)用前景。在食品加工處理過程中會(huì)產(chǎn)生一種致癌物質(zhì)丙烯酰胺，而在食品加工處理前加入適量的L-天冬酰胺酶可以有效降低食品中丙烯酰胺的含量。Pedreschi研究顯示，在食品預(yù)處理過程中加入L-天冬酰胺酶可以使丙烯酰胺的含量下降約92.28%[3]。由于酶促反應(yīng)的條件一般較溫和，在食物加工預(yù)處理階段加入L-天冬酰胺酶，不僅能達(dá)到減少丙烯酰胺含量的目的，還不會(huì)對(duì)食品風(fēng)味產(chǎn)生較大的影響[4]。并且經(jīng)過前期的研究證實(shí)，在該反應(yīng)過程中不會(huì)生成對(duì)人身體有害的物質(zhì)，因此利用酶法預(yù)處理需高溫加工的食品原料，是一種可從源頭上減少食物中丙烯酰胺生成的有效方法。

近年來，L-天冬酰胺酶在食品產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用研究及開發(fā)已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注，也面臨著一些新的挑戰(zhàn)。由于食品加工預(yù)處理環(huán)境條件的復(fù)雜性，這就要求酶在較廣的pH和溫度范圍保持高的催化活力。目前，耐高溫、耐酸堿、高比酶活的L-天冬酰胺酶在食品工業(yè)方面具有更高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

為了獲得具有滿足工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用需求的蛋白質(zhì)分子，蛋白質(zhì)工程手段已被廣泛應(yīng)用于對(duì)酶蛋白功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行改良的研究中[5]。2013年Vidya等研究發(fā)現(xiàn)對(duì)Escherichia sp.中L-天冬酰胺酶進(jìn)行點(diǎn)突變后，蛋白質(zhì)表面環(huán)上電荷得到優(yōu)化，且有效增加了酶的熱穩(wěn)定性[6]。龍水清等對(duì)Bacillus subtilis B11-06的L-天冬酰胺酶（BsAII）進(jìn)行定點(diǎn)突變，篩選得到的L-天冬酰胺酶突變體具有更高的比酶活以及熱穩(wěn)定性[7-8]。

作者基于課題組前期將Pyrococcus yayanosii CH1來源的L-天冬酰胺酶在Bacillus subtilis168中成功克隆表達(dá)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用分子模擬、定點(diǎn)突變等手段對(duì)其進(jìn)行改造以期提高其比酶活和熱穩(wěn)定性，進(jìn)一步提高其工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

E.coli和B.subtilis穿梭質(zhì)粒pMA5、克隆宿主E.coli JM109、表達(dá)宿主B.subtilis 168由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。限制性核酸內(nèi)切酶、PrimeSTAR?HS DNA聚合酶和T4DNA連接酶：購自TaKaRa生物公司（大連，中國(guó)）；小型質(zhì)?？焖俜蛛x試劑盒、DNA提取試劑盒和Mini DNA快速純化試劑盒等：購自Sangon Biotech Co.，Ltd（上海，中國(guó)）；HisTrapTM HP柱：購自GE Healthcare，Inc（英國(guó)）。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 L-天冬酰胺酶基因定點(diǎn)突變和重組質(zhì)粒的構(gòu)建以實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMA5-asn為模板，每一個(gè)擬突變株設(shè)計(jì)2條含有突變位點(diǎn)及重疊部分的引物（見表1）[9]，利用這些突變引物通過PCR的方法，使基因在重疊延伸的過程中攜帶上目的突變點(diǎn)。將獲得的PCR產(chǎn)物用BamH I和Mlu I限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，并利用瓊脂糖凝膠電泳回收該雙酶切產(chǎn)物，與同樣進(jìn)行了雙酶切及瓊脂糖凝膠電泳回收的線性化穿梭質(zhì)粒pMA5，利用T4 DNA連接酶于16℃連接12 h，并將所得連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證后，再進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)是否正確引入突變點(diǎn)，并將突變正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌Bacilus subtilis 168感受態(tài)細(xì)胞中。

表1 基因克隆及定點(diǎn)突變引物Table 1 Primers used for site-directed mutagenesis and

1.2.2 L-天冬酰胺酶的表達(dá)和純化將重組枯草芽孢桿菌接種至含有終質(zhì)量濃度為20μg/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中（成分（g/L）：NaCl 10，蛋白胨10，酵母浸出物5），于37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，作為種子液。取1 mL該種子液接種在100 mL的新鮮LB培養(yǎng)基上，并在相同條件下培養(yǎng)24 h，得到擴(kuò)培后的重組枯草芽孢桿菌細(xì)胞。將獲得的細(xì)胞于4℃、10 000 r/min離心10 min，取其上清液作為胞外粗酶液，用于胞外L-天冬酰胺酶酶活測(cè)定。取其細(xì)胞用裂解緩沖液（50 mmol Tris-HCl緩沖液，pH 8.0）重復(fù)洗滌細(xì)胞2～3次后，然后在細(xì)胞裂解緩沖液中加入6 mg/mL溶菌酶，放置2 h，再于20 MHz，45%功率下，超聲處理細(xì)胞30 min。將所得細(xì)胞裂解物在12 000 r/min下離心25 min，收集上清液作為胞內(nèi)粗酶液，于-20℃保藏。

胞內(nèi)粗酶液的分離純化采取Ni2+親和層析和AKTA純化系統(tǒng)（GE Healthcare，瑞典）。以0.5 mL/min的流速將粗酶液加載到利用結(jié)合緩沖液（0.02 mol Tris-HCl緩沖液，0.5 mol NaCl，pH 7.4）平衡后的1 mL HisTrap TMHP柱上。采用0～0.5 mol的咪唑線性梯度，1 mL/min的流速洗脫L-天冬酰胺酶。然后將純化后的酶用PB緩沖液（0.05 mol，pH 7.0）或Tris-HCl緩沖液（0.05 mol，pH 7.0）透析，除去酶液中殘存的咪唑。并將最終純化后的酶進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

1.2.3 L-天冬酰胺酶酶活的測(cè)定L-天冬酰胺酶活力采用Long和Zuo等人的奈斯勒試劑法，通過測(cè)定酶促反應(yīng)所生成氨的量來計(jì)算酶促反應(yīng)速率[10-11]。酶活力單位定義：在一定條件下，每分鐘內(nèi)產(chǎn)生1μmol氨氣所需的酶量為1個(gè)酶活單位，采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度[12]。在95℃下對(duì)底物（1 mL的25 mmolL-天冬酰胺和50 mmol、pH 8.0 Tris-HCl混合物）進(jìn)行預(yù)熱后，加入100μL酶溶液，反應(yīng)進(jìn)行10 min后加入100μL 15 g/dL的三氯乙酸（TCA）終止反應(yīng)。反應(yīng)后的混合物體系以20 000 r/min離心10 min，取200μL澄清上清液加入4.8 mL去離子水中，并加入200μL奈斯勒試劑反應(yīng)，在450 nm的分光光度計(jì)下檢測(cè)系統(tǒng)中釋放的氨的量。對(duì)照組在酶促反應(yīng)前加入100μL的15 g/dL三氯乙酸提前終止反應(yīng)，以除去由于高溫下L-天冬酰胺自水解帶來的誤差。

1.2.4 L-天冬酰胺酶最適溫度、最適pH及溫度穩(wěn)定性測(cè)定最適溫度測(cè)定：在pH 8.0條件下，40～100℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行酶反應(yīng)，測(cè)定不同溫度下的L-天冬酰胺酶酶活，并依此確定其最適溫度。

最適pH測(cè)定：保持溫度為95℃，在不同pH值條件下進(jìn)行酶反應(yīng)測(cè)定其對(duì)應(yīng)的L-天冬酰胺酶酶活。根據(jù)所需的pH值范圍采用的不同pH緩沖液分 別 為：0.05 mol乙 酸 鹽 緩 沖 液，pH 4.0～6.0；0.05 mol磷酸鹽緩沖液，pH 6.0～7.0；0.05 mol Tris-HCl緩沖液，pH 7.0～9.0；0.05 mol甘氨酸-NaOH緩沖液，pH 9.0～10.0。

溫度穩(wěn)定性檢測(cè)：將含L-天冬酰胺酶的Tris-HCl緩沖液（50 mmol，pH 7.0），置于85℃水浴鍋中15～120 min，再在冰上重新折疊15 min，并在95℃、pH 8.0的條件下測(cè)定體系中殘余的L-天冬酰胺酶酶活性。

1.2.5 L-天冬酰胺酶三維結(jié)構(gòu)模擬及分析使用Prot Param來預(yù)測(cè)L-天冬酰胺酶的相對(duì)分子質(zhì)量、理論pI和不穩(wěn)定指數(shù)。通過使用SWISS-MODEL同源建模獲得L-天冬酰胺酶的結(jié)構(gòu)模型，并使用VERIFY_3D服務(wù)器對(duì)模型質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)[13-14]。利用PYMOL軟件分析氨基酸殘基之間的相互作用[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-天冬酰胺酶分子建模突變點(diǎn)選擇

Pyrococcus yayanosii CH1 L-天冬酰胺酶是由987個(gè)堿基編碼而成的具有328個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)酶。經(jīng)ProtParam預(yù)測(cè)得到L-天冬酰胺酶相對(duì)分子質(zhì)量大小約為3.61×104，理論pI值約為5.16，不穩(wěn)定指數(shù)約為29.80，可認(rèn)為該酶有較好的穩(wěn)定性[16]。為了對(duì)獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行更深層次的分析，將L-天冬酰胺酶PyAsnase的氨基酸序列上傳到SWISSMODEL服務(wù)器，選擇了與其序列相似度達(dá)到65%的同源二聚體蛋白為模板，得到了L-天冬酰胺酶的三維結(jié)構(gòu)模型。并利用VERIFY▁3D服務(wù)器對(duì)獲得模型的質(zhì)量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示92.02%的殘基的平均3D-1D的評(píng)分大于0.2，已達(dá)到了質(zhì)量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)（≥80%的殘基的3D-1D評(píng)分大于0.2）[9]，可以用于更進(jìn)一步的研究分析。

為了提高Pyrococcusya yanosii CH1來源的L-天冬酰胺酶的比酶活和熱穩(wěn)定性，挑選3條酶活較高且為嗜熱來源的L-天冬酰胺酶，將這些酶的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比（見圖1），從而確定與酶活性有關(guān)的氨基酸位點(diǎn)以及在高度保守序列附近可能會(huì)提高P.yayanosii CH1來源L-天冬酰胺酶的比酶活或熱穩(wěn)定性的突變位點(diǎn)。其中，結(jié)合近年來學(xué)者們對(duì)L-天冬酰胺酶的活性位點(diǎn)的研究，作者認(rèn)為高度保守的11T、21Y、52S、83T、84D、154K位點(diǎn)為該L-天冬酰胺酶與酶活性有關(guān)的位點(diǎn)。在高度保守序列附近，我們發(fā)現(xiàn)P.yayanosii CH1來源的L-天冬酰胺酶的氨基酸序列中E22、M92、R111位點(diǎn)與其他3個(gè)嗜熱來源L-天冬酰胺酶的氨基酸序列差別較大，且其余3個(gè)嗜熱來源的氨基酸序列在這些位點(diǎn)具有較好的保守性，因此選擇這3個(gè)位點(diǎn)作為突變位點(diǎn)。突變位點(diǎn)在酶空間結(jié)構(gòu)上的位置如圖2所示。

圖1 不同來源L-天冬酰胺酶氨基酸序列對(duì)比結(jié)果Fig.1 Sequences alignment of L-asparaginases from different bacteria

圖2 來自Pyrococcus yayanosii CH1的L-天冬酰胺酶三級(jí)結(jié)構(gòu)及突變位點(diǎn)示意圖Fig.2 Tertiary structure of the P.yayanosii CH1 Lasparaginase and schematic diagram of the mutation sites

2.2 L-天冬酰胺酶突變后酶學(xué)性質(zhì)的研究

按照上述實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定酶的最適溫度及最適pH，所得結(jié)果如表2所示?？梢钥闯觯蛔兦昂竺傅淖钸m溫度與最適pH基本保持不變，最適溫度約為95℃，最適pH值約為8.0。在最適溫度（95℃）及最適pH（8.0）條件下分別測(cè)定突變體酶與原始酶的酶活，結(jié)果顯示，E22K突變體酶的酶活約為2 037.13 U/mg，較原始酶酶活（約1 483.81 U/mg）相比提高了約37.3%。R111L突變體酶的酶活約為1 945.11 U/mg，相比于原始酶提高了31.3%。M92A突變體酶的酶活約為1 421.78 U/mg，是原始酶的95%。即可以認(rèn)為，E22、R111位點(diǎn)的突變可以進(jìn)一步提高酶的比酶活。M92號(hào)位點(diǎn)的突變雖然導(dǎo)致酶活降低，但是波動(dòng)幅度較小。

表2 突變體酶的酶學(xué)性質(zhì)Table 2 The enzymatic properties of the wild-type and its variants

為了進(jìn)一步了解酶的熱穩(wěn)定性變化，將含突變體酶與原始酶的緩沖液在85℃水浴鍋中放置15～120 min，再在冰上重新折疊15 min，并在95℃、pH 8.0的條件下測(cè)定體系中殘余的L-天冬酰胺酶酶活性。其中，原始酶、E22K和R111L突變體酶在85℃下，放置105 min仍有較高的酶活，熱穩(wěn)定性基本保持不變。M92A突變體酶在85℃下放置135 min仍有較高的酶活，相比于原始酶延長(zhǎng)了30 min。因此，將M92號(hào)位點(diǎn)突變成A92在提高酶的熱穩(wěn)定性方面有較好的效果。

2.3 突變體酶三維結(jié)構(gòu)分析

為了分析突變體酶E22K、M92A、R111L的酶活或者熱穩(wěn)定性提高的原因，根據(jù)建立的L-天冬酰胺酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型，從氨基酸殘基間的相互作用力和空間的結(jié)構(gòu)變化的角度來對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，其變化情況見圖3。

圖3 突變前后氨基酸殘基的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)對(duì)比Fig.3 Tertiary structures of the wild-type and mutant enzymes

一般認(rèn)為，活性區(qū)域附近的高柔性及更利于底物、產(chǎn)物進(jìn)入活性口袋的酶結(jié)構(gòu)會(huì)使酶出現(xiàn)較高的比酶活和較低的活化能[17-18]。而從圖3可以看出，突變殘基E22K與R111L分別位于不同的柔性環(huán)上。突變前E22與S17、K274殘基形成氫鍵，而突變后，K22與這2個(gè)氨基酸殘基不能再形成氫鍵，這種與周圍氨基酸殘基氫鍵相互作用的減弱，可能會(huì)增加酶活性中心的柔韌度，更有利于對(duì)底物的捕捉以及產(chǎn)物的釋放，進(jìn)而提高酶的比活力。同樣，突變后的L111不能再與G117形成氫鍵，增加了酶活性中心的柔韌度，而且突變后的L111的殘基比突變前R111的殘基小，產(chǎn)生的空間位阻相對(duì)較小，進(jìn)一步促進(jìn)了底物和產(chǎn)物的進(jìn)出，從而提高了酶的比活力。

蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性一般與蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水性、表面的親水性、表面電荷分布以及分子內(nèi)氨基酸殘基的相互作用等有關(guān)。從氨基酸殘基的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖可以看出第92位氨基酸位于α-螺旋中，且將M92換成A92后，酶的熱穩(wěn)定性得到了較大幅度的提高，這表明92號(hào)位點(diǎn)對(duì)P.yayanosii CH1來源的L-天冬酰胺酶維持三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有重要的作用。

3 結(jié)語

在前期的研究中，學(xué)者們大多對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等來源的L-天冬酰胺酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，獲得的L-天冬酰胺酶突變體熱穩(wěn)定性雖然有所提高，但受到酶來源的限制，其穩(wěn)定性仍有較高的提升空間。而本實(shí)驗(yàn)中利用熱穩(wěn)定性良好的嗜熱P.yayanosii CH1來源的L-天冬酰胺酶，通過分子模擬、定點(diǎn)突變等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分子改造，進(jìn)一步提高了該酶的比活力和熱穩(wěn)定性，提高了其在工業(yè)、食品方面的應(yīng)用潛力。證明了L-天冬酰胺酶催化活性中心的柔韌度對(duì)比酶活有一定影響，其中的E22K與R111L突變株所得酶的比酶活分別提高了37%和31%，并且證明了位于α-螺旋上的92號(hào)位氨基酸對(duì)L-天冬酰胺酶的熱穩(wěn)定性有較大影響，將M92突變成A92能使其在85℃下的半衰期延長(zhǎng)30 min。本研究對(duì)其他來源的L-天冬酰胺酶的改造具有相應(yīng)的參考價(jià)值。