張瑞雪，張江濤，方 磊，凌 空，朱 艷，李明亮，谷瑞增，魏 穎

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京100015）

尿酸是人體嘌呤代謝的終產物，其生成過多或排出過少均可導致尿酸水平升高，從而患高尿酸血癥，而高尿酸血癥是急性關節(jié)炎、痛風、腎結石和尿酸性腎病重要的生化基礎，而且與高血壓、糖尿病、冠心病等多種傳統(tǒng)血管疾病密切相關[1]。隨著人們生活水平提高，高蛋白質和高嘌呤食物攝入量在日常生活中顯著增加，高尿酸患病率也逐年提高[2]。

目前藥物治療高尿酸血癥的方法有2種，其一為增加尿酸排泄，主要抑制腎小管對尿酸的再吸收，如苯溴馬隆和丙磺舒，但是可能會導致尿酸鹽結晶在尿管的沉積，從而引發(fā)腎功能損傷[3-4]；其二是減少尿酸生成，主要是黃嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XOD）抑制劑，如別嘌呤醇，不良反應有過敏性皮疹、腎毒性和肝壞死等[5]。鵝肌肽是動物體內的一種組氨酸二肽，通常從家禽骨骼肌中提取，具有顯著的抗氧化、抗疲勞、降尿酸等功能，在特醫(yī)食品和保健品領域已有應用[6-9]。目前鮮有文章報道鵝肌肽對高尿酸血癥的作用，作者對其進行初探，以期后續(xù)深入研究鵝肌肽的降尿酸功能和機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉：中食海氏生物技術有限公司產品；小鼠（Balb/c，6～8周齡）：北京維通利華實驗動物技術有限公司產品，許可證號為SCXK（京）2016-0006；氧嗪酸鉀、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）：北京索萊寶科技有限公司產品；別嘌呤醇：Sigma公司產品；UA、UN、CRE、XOD、ADA、AST、ALT、TG試劑盒：南京建成生物科技有限公司產品。

1.2 儀器與設備

Spectra MR多功能酶標儀：美國Dynex公司產品；恒溫水浴鍋：蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司產品；-80℃冰箱：Thermo Scientific公司產品；高速勻漿機：BioSpec Products公司產品；高速離心機：Sigma公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 鵝肌肽的酶解制備工藝通過本中心所優(yōu)化的低聚肽制備方法制備富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物：雞胸肉→粉碎→溶解→預熱、調pH→酶1/酶2→滅酶→離心分離→脫色、脫鹽→噴霧干燥→鵝肌肽粉（酶1對應樣品1、酶2對應樣品2）。

1.3.2 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物氨基酸組成測定 參照國標法GB/T 5009.124[10]，測定樣品1和樣品2的氨基酸組成。

1.3.3 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物相對分子質量分布測定采用文獻所述高效凝膠過濾色譜法[11]，測定樣品1和樣品2相對分子質量及分布情況。

1.3.4 動物分組將54只小鼠稱重后隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組（別嘌呤醇10 mg/kg）樣品1低（38.5 mg/kg）、中（77 mg/kg）、高（154 mg/kg）劑量組，樣品2低（38.5 mg/kg）、中（77 mg/kg）、高（154 mg/kg）劑量組共9組，每組6只。動物房溫度為（24±1）℃，濕度（55±5）%，試驗條件嚴格遵守《實驗動物管理條例》相關規(guī)定。

1.3.5 動物給藥及急性高尿酸血癥模型建立對各組小鼠每天灌胃前一晚禁食，空白組和模型組每天灌胃生理鹽水，陽性對照組每天灌胃別嘌呤醇，實驗組每天灌胃富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物低、中、高劑量。每日稱量小鼠體質量，根據體質量調整灌胃量，連續(xù)7 d。在最后一次灌胃1 h前，除空白對照組外，其余8組小鼠腹腔注射氧嗪酸鉀鹽500 mg/kg（混懸于質量濃度0.5 g/dL羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液）進行造模[12]，以造成小鼠急性高尿酸血癥，空白對照組按同樣劑量腹腔注射0.5 g/dL CMC-Na溶液。腹腔注射1 h后，眼眶取血，4℃靜置30 min后，5 000 r/min離心10 min，取上清液于-80℃凍存待檢測。于冰臺上分取肝臟、腎臟及脾臟組織，稱質量記錄并于-80℃凍存待檢測。

1.3.6 指標檢測血清中尿酸（UA）、尿素氮（UN）及肌酐（CRE）水平按試劑盒說明測定。取小鼠肝臟組織于玻璃勻漿器中，在冰水浴條件下按1 g∶9 mL的比例加入生理鹽水（0.86 g/dL）反復勻漿，4℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明測定肝臟中黃嘌呤氧化酶（XOD）、腺苷脫氨酶（ADA）、谷谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、甘油三酯（TG）水平。

1.3.7 數據處理采用Origin8.5統(tǒng)計軟件對數據進行處理，實驗結果以均值±標準偏差（Mean±SD）表示。采用組間t檢驗，P＜0.05具有顯著性差異，P＜0.01具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物的氨基酸組成

氨基酸組成和質量分數如表1所示，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、組氨酸、賴氨酸的質量分數較高，且富含人體必需的氨基酸和半必需氨基酸。其中質量分數最高的組氨酸是組成機體蛋白質的氨基酸之一，同時也是動物合成肌肽和鵝肌肽等功能性二肽的前體物質，在調控動物生長、提高機體抗氧化能力和肌肽含量等方面發(fā)揮重要作用[13]。

表1 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of chicken breast hydrolysate enriched with anserine

2.2 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物的相對分子質量分布

鵝肌肽相對分子質量分布情況如表2所示。鵝肌肽的相對分子質量大部分分布在1 000之下，樣品1和樣品2分別占總比例的94.53%和95.44%，其中在140～500之間的比例最高，樣品1和樣品2分別為61.41%和74.20%。在此相對分子質量范圍內，一般都是二肽和三肽，此類小分子肽易消化吸收，比游離氨基酸的吸收率提高2.0～2.5倍，且具有大分子蛋白質所沒有的一些物理化學特性[14-15]。

表2 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物分子質量分布Table 2 Molecular weight distribution of chicken breast hydrolysate enriched with anserine

2.3 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物對高尿酸血癥小鼠臟器指數的影響

尿酸合成過程中的重要酶類主要分布在肝臟中，如XOD。XOD可通過調控尿酸代謝激活炎性小體途徑來加重肝細胞脂質堆積，且尿酸在體內可直接誘導小鼠肝臟胰島素抵抗[16]。腎臟是尿酸排泄的關鍵臟器，高尿酸易致腎臟血液動力學、組織學和功能學改變，引起腎結石、腎纖維化、慢性腎病等嚴重后果[17]。由表3可看出，與空白組比，模型組小鼠的肝臟指數、腎臟指數極顯著升高（P＜0.01），說明小鼠急性高尿酸血癥腎病模型復制成功。與模型組相比，陽性對照組的腎臟指數極顯著降低（P＜0.01），但是對肝臟指數并沒有顯著影響，樣品1和樣品2的中劑量均能極顯著降低肝臟指數和腎臟指數（P＜0.01），甚至達到空白組的正常水平。

表3 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物對急性高尿酸血癥小鼠肝臟指數和腎臟指數的影響Table 3 Effects of chicken breast hydrolysate enriched with anserine on liver and kidney index in mice with acute hyperuricemia

2.4 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物對高尿酸血癥小鼠血清UA濃度的影響

約在1 500萬年前，人類的尿酸酶基因發(fā)生突變，導致尿酸不能被肝臟降解為尿囊素排出體外，成為人嘌呤代謝的最終產物[1]。正常男性血尿酸為150～380μmol/L，女性更年期以前為100～300μmol/L，更年期后其值接近男性。37℃時，血清尿酸的飽和濃度約為416μmol/L，高于此值即為高尿酸血癥[18]。高尿酸可以通過激活氧化應激、誘導TGF/smad信號通路的炎癥反應等對腎臟造成損傷[19]。所以防治高尿酸血癥，首先要降低體內尿酸水平。

模型組血尿酸濃度明顯升高，與空白對照組相比有極顯著性差異（P＜0.01）。與模型組相比，陽性對照組可極顯著地（P＜0.01）降低模型組動物血清中的UA水平，降低了28.49%；樣品1和樣品2的低、中劑量均可極顯著（P＜0.01）降低患有急性高尿酸小鼠的血清UA濃度，與模型組相比，分別降低了39.86%、45.71%、41.99%、34.60%。樣品1的中劑量的降尿酸效果最好，并且明顯（P＜0.01）強于陽性對照組，此時UA濃度為165.28μmol/L，接近于空白組的UA水平136.10μmol/L，見圖1。

圖1 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物對急性高尿酸血癥小鼠血清UA濃度的影響Fig.1 Effects of chicken breast hydrolysate enriched with anserine on serum UA concentration in mice with acute hyperuricemia

2.5 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物對高尿酸血癥小鼠血清CRE和UN濃度的影響

血清中的肌酐和尿素氮可反映腎功能的好壞。肌酐是在肌肉中從磷酸肌酸通過自發(fā)不可逆轉化而形成的，通常情況所形成的肌酐量是相當恒定的，游離肌酐的循環(huán)量完全依賴于它的排泄速度[20]。尿素是人體內蛋白代謝的主要產物，構成的了血液中絕大部分的非蛋白氮。血中尿素氮來源于肝臟，通過腎臟隨尿液排出體外[21]。血清肌酐和尿素氮的濃度可反映腎小球的濾過作用、腎小管的重吸收功能和尿路的通暢[22]。腎功能不足時，肌酐和尿素氮的濃度升高。

模型組的CRE和UN濃度與空白對照組相比極顯著升高（P＜0.01）；陽性對照組的CRE濃度與模型組相比，極顯著降低（P＜0.01）了61.59%，但是陽性對照組的藥物別嘌呤醇對UN濃度沒有顯著影響。樣品1和樣品2的低、中高劑量均可極顯著（P＜0.01）降低模型小鼠的血清CRE和UN濃度。樣品2低、中、高劑量的能顯著恢復CRE濃度至正常水平46.88μmol/L，且效果優(yōu)于陽性對照組，見圖2。

圖2 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物對急性高尿酸血癥小鼠血清CRE和UN濃度的影響Fig.2 Effects of chicken breast hydrolysate enriched with anserine on serum CRE and UN concentrations in mice with acute hyperuricemia

2.6 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物對高尿酸血癥小鼠肝臟ADA和XOD活力的影響

XOD和ADA都是嘌呤核苷酸分解代謝途徑中的重要酶類，主要存在于肝臟中，其中XOD可連續(xù)氧化黃嘌呤、次黃嘌呤生成尿酸，ADA可催化腺嘌呤核苷分解為次黃嘌呤核苷，而后經核苷磷酸化酶催化生成次黃嘌呤，再經XOD的氧化作用最終生成尿酸[23]。故當機體攝入過多的核酸時，XOD和ADA活性的升高有利于加速這些核酸的分解代謝，合成尿酸，尿酸合成的簡要流程示意圖見圖3。

鵝肌肽對小鼠肝臟ADA和XOD活力的影響與空白組相比，模型組的ADA和XOD活力極顯著提高（P＜0.01）。在灌胃給藥別嘌呤醇后，與患有急性高尿酸血癥的模型組小鼠相比，肝臟的ADA和XOD活力極顯著下降（P＜0.01），樣品1的低、中、高劑量均能極顯著降低ADA酶的活力（P＜0.01），此時的ADA的酶活力分別為75.6、74.7、74.2 U/mg，已恢復至空白組小鼠肝臟的酶活力（75.6 U/mg）。樣品2的低、中劑量也能極明顯降低ADA酶活力（P＜0.01），高劑量則不能達到此效果。富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物對抑制XOD活力的效果沒有陽性對照組好，與模型組相比，只有樣品1的低劑量能顯著降低XOD活力（P＜0.05），見圖4。

2.7 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物對高尿酸血癥小鼠肝臟AST和ALT活力的影響

AST和ALT是廣泛存在于動物肝臟細胞質和線粒體中的2種重要的轉氨酶，這2種酶活性高低反映小鼠體內氨基酸代謝的情況，同時可以敏感地反映肝細胞的細胞膜完整程度[24]。有文獻表明高尿酸血癥與AST、ALT水平升高有關，血尿酸水平升高是肝臟轉氨酶水平升高的獨立危險因素，當ALT與AST出現(xiàn)明顯異常升高時可能提示機體內已經出現(xiàn)代謝紊亂，ALT早已用于臨床來作為肝臟損傷的標志物之一[25]。

富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物對小鼠肝臟AST和ALT活力的影響見圖5，模型組肝臟內ALT和AST活力極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，樣品1可以極顯著降低ALT活性（P＜0.01），分別降低了28.443%、12.21%、24.21%，且低劑量降低酶活性的效果強于陽性對照組（P＜0.01），高劑量可極顯著降低AST活性（P＜0.01）10.00%；樣品2中劑量可極顯著降低2個轉氨酶的活性，尤以降低AST活性效果明顯。

圖5 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物對急性高尿酸血癥小鼠肝臟AST和ALT活力的影響Fig.5 Effects of chicken breast hydrolysate enriched with anserine on liver AST and ALT activities in mice with acute hyperuricemia

2.8 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物對高尿酸血癥小鼠肝臟TG濃度的影響

肝臟脂肪代謝功能降低，會導致脂類物質在肝臟內堆積，進而造成肝臟的脂肪性病變，抑制XOD的表達可減少尿酸生成并顯著減輕肝細胞TG含量和脂質沉積[16]。富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物對小鼠肝臟TG濃度的影響見圖6，與對照組相比，模型組的TG濃度極顯著增高（P＜0.01）。樣品1低劑量能極顯著降低TG濃度（P＜0.01），與模型組相比降低了42.57%，且各劑量對TG濃度的影響趨勢與對XOD活力的影響表現(xiàn)出一致性。

圖6 富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物對急性高尿酸血癥小鼠肝臟TG濃度的影響Fig.6 Effects of chicken breast hydrolysate enriched with anserine on liver TG concentration in mice with acute hyperuricemia

3 結語

作者對富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物緩解高尿酸血癥的功能進行了研究，結果表明酶解物能緩解肝臟和腎臟指數，樣品1和樣品2的中劑量效果最為明顯，效果優(yōu)于別嘌呤醇，且該劑量能有效降低血清的UA水平。樣品1和樣品2的鵝肌肽均能降低患有高尿酸血癥的血清UN和CRE水平，富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物對抑制XOD活力的效果沒有別嘌呤醇好，且只有樣品1的低劑量能顯著降低XOD活力；樣品1和樣品2均能降低ADA活力，樣品1可以極顯著降低ALT活性，且低劑量降低酶活性的效果強于別嘌呤醇，高劑量可極顯著降低AST活性。富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物對肝臟TG濃度的影響與對XOD的影響趨勢具有一致性，證實了TG濃度與XOD活力具有相關性。綜上所述，富含鵝肌肽的雞胸肉酶解物具有一定的降尿酸功能，且緩解腎臟和肝臟的部分功能，可能與調節(jié)肝臟的轉氨酶（AST、ALT）活力或者表達有關，后續(xù)將進一步進行研究和探討。