梁曉強(qiáng) 梅 丹 余 奎 章學(xué)林 顧宏剛 張靜喆 沈 平

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200032；2.上海市金山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海201501）

慢 性 胰 腺 炎（chronic pancreatitis，CP）是 由各種原因?qū)е碌囊认俳M織結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生的持續(xù)性損害，近年在我國的發(fā)病率有上升趨勢(shì)，其典型病理表現(xiàn)是胰腺纖維化[1-2]，本質(zhì)是細(xì)胞外 基 質(zhì)（extracellular matrix，ECM）因 合 成 增多或降解減少導(dǎo)致ECM沉積。胰腺星狀細(xì)胞（pancreatic stellate cell，PSC）的活化啟動(dòng)胰腺纖維化發(fā)生。CP主要表現(xiàn)為內(nèi)、外分泌功能異常，其中外分泌功能不全主要表現(xiàn)為脂肪瀉、體質(zhì)量下降、營養(yǎng)消化吸收不良等癥狀[3]。內(nèi)分泌功能障礙表現(xiàn)為不同程度的糖代謝異常，包括血糖升高和胰島素分泌減少[4-7]。前期研究證實(shí)，大黃、丹參可以通過抑制ECM合成發(fā)揮抗胰腺纖維化的作用[8]。本研究同時(shí)著眼于胰腺纖維化形成和內(nèi)分泌功能改變兩個(gè)方面，采用腹腔注射二乙基二硫代氨基甲酸鈉（DDC）制備胰腺纖維化大鼠模型，觀察模型大鼠胰腺纖維化和內(nèi)分泌功能的變化及大黃丹參水煎液的干預(yù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí) 驗(yàn) 動(dòng) 物 SD大 鼠，雄 性，SPF級(jí)，體 重（200±20）g，由上海市斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，合格證號(hào)：2015000502794。本研究實(shí)驗(yàn)方案符合《中國動(dòng)物保護(hù)法》的程序、倫理準(zhǔn)則和上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)倫理原則，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院審核批準(zhǔn)，并按照相關(guān)指南和規(guī)定進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 大黃（產(chǎn)地甘肅）和丹參（產(chǎn)地山東）由龍華醫(yī)院中藥房提供。取大黃、丹參各15 g水煎濃縮，制備成每毫升分別含生藥量0.137 g、0.274 g、0.548 g的濃縮液。

1.3 主要儀器和試劑 J-301高速冷凍離心機(jī)（Beckman公司，USA），TP1020脫水機(jī)、EG1160包 埋 機(jī) 及CM1900冷 凍 切 片 機(jī)（Leica公司，Germany），酶標(biāo)儀 BioTek synergy H1（伯騰儀器有限公司，USA），日立全自動(dòng)生化分析儀（HITACHI7170，Japan），投射電子顯微鏡（FEI公 司，Tecnai G2 Spirit BioTWIN，USA），層 粘 連蛋白（LN）、Ⅰ型膠原（col-1）、透明質(zhì)酸（HA）的ELASA試劑盒及α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）免疫組化試劑盒由江蘇凱基生物技術(shù)有限公司（KeyGen Biotech）提供，血清胰島素試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供，DDC由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模與給藥 50只SD大鼠體質(zhì)量經(jīng)均衡后，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組和大黃丹參高、中、低劑量組，每組10只。造模期間不限飲食和攝水。模型組和大黃丹參各劑量組采用腹腔注射DDC（500 mg/kg體重）建立胰腺纖維化模型[9]，每周2次，連續(xù)6周（免疫組化檢測胰腺組織α-SMA呈陽性表達(dá)，證實(shí)造模成功），正常組腹腔注射等量生理鹽水。在造模的同時(shí)，大黃丹參各劑量組予相應(yīng)劑量藥物灌胃，藥物劑量按成人劑量（60 kg體重，大黃和丹參分別15 g/d），依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體型系數(shù)[10]換算得高、中、低劑量分別為每日5.48、2.74、1.37 g/kg體重，2 mL/次，1次/d，分別相當(dāng)于成人用量的11倍、5.5倍、2.75倍。每2周依據(jù)稱重結(jié)果調(diào)整灌胃劑量。正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。

2.2 標(biāo)本采集和制備 各組大鼠均于造模結(jié)束后取材。戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置后離心取血清，-20 ℃保存待測。取胰腺組織，一部分用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，室溫保存，行5 μm切片，行HE染色和免疫組化測定；另一部分胰腺組織用2.5%戊二醛固定至少2 h，送至上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行電鏡檢測。

2.3 指標(biāo)檢測 HE染色后光鏡下觀察胰腺大體形態(tài)變化，電鏡觀察胰腺超微結(jié)構(gòu)變化，免疫組化檢測胰腺α-SMA表達(dá)。各組隨機(jī)取6只大鼠血清ELASA法檢測LN、col-1、HA含量，葡萄糖氧化法檢測血清空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）含量，放射免疫法檢測血清空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)ins）含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以（±s）表示。多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠胰腺大體形態(tài)學(xué)比較 正常組大鼠胰腺結(jié)構(gòu)清晰，腺泡排列整齊，腺管無擴(kuò)張，腺泡小葉完整；模型組大鼠胰腺呈萎縮狀，胰腺導(dǎo)管和腺泡結(jié)構(gòu)破壞，纖維組織增生，部分小葉間構(gòu)成一片紅染的無結(jié)構(gòu)區(qū)，形成假小葉，胰腺間質(zhì)可見大量炎細(xì)胞浸潤；大黃丹參各劑量組大鼠胰腺較模型組纖維化程度減輕，胰腺和小葉結(jié)構(gòu)尚完整，伴有不同程度的炎細(xì)胞浸潤，嗜酸性細(xì)胞增多，隨中藥劑量增加其纖維化程度逐漸減輕。見圖1。

3.2 各組大鼠胰腺組織超微結(jié)構(gòu)比較 電鏡下正常組大鼠胰腺偶見腺胞，上皮細(xì)胞線粒體輕度腫脹，間質(zhì)內(nèi)纖維無明顯增多；模型組大鼠胰腺可見間質(zhì)內(nèi)纖維增多，腺胞內(nèi)線粒體明顯腫脹、透明，伴多囊泡形成，組織間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞明顯增多，另可見大量纖維成分，胰腺腺胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，腺胞體積減小；大黃丹參各劑量組較模型組纖維化有不同程度的減輕。見圖2。

3.3 各組大鼠胰腺組織α-SMA表達(dá)比較 正常組大鼠胰腺內(nèi)偶見血管壁細(xì)胞胞漿著染淡黃色，說明α-SMA表達(dá)較弱；模型組大鼠胰腺內(nèi)血管壁、小葉間、小葉內(nèi)間質(zhì)及胰島中均可見α-SMA表達(dá)，著色棕黃色或淡黃色呈彌漫性分布；大黃丹參各劑量組大鼠胰腺內(nèi)α-SMA表達(dá)呈散在分布，染色較淡，明顯弱于模型組。見圖3。

圖2 各組大鼠胰腺組織超微結(jié)構(gòu)比較（×4200）

圖3 各組大鼠胰腺α-SMA表達(dá)（×200）

3.4 各 組 大鼠血 清LN、col-1、HA、FBG及Fins含量比較 結(jié)果見表1。

4 討論

4.1 大黃、丹參抗胰腺纖維化的臨床與實(shí)驗(yàn)依據(jù)及糖代謝異常在CP中的重要意義 胰腺纖維化屬于中醫(yī)學(xué)“泄瀉”“腹痛”等范疇，主要病機(jī)為氣滯血瘀，臨床多用理氣活血化瘀法，常用藥物以大黃、丹參為主。在萬方數(shù)據(jù)庫檢索近10年（2010—2019年）文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)含大黃或丹參的復(fù)方及其有效成分用于治療器官纖維化的臨床及實(shí)驗(yàn)報(bào)道居于首位（大黃382篇，丹參759篇），且以抗肝纖維化為主（分別占61%和56%）。此外，二藥對(duì)肺、腎等其他器官纖維化亦存在調(diào)控作用。但是聯(lián)合應(yīng)用大黃、丹參以干預(yù)纖維化的論文僅10篇（其中4篇，即文獻(xiàn)[8]與文獻(xiàn)[11-13]，均由本項(xiàng)目組陸續(xù)發(fā)表），分別從中醫(yī)理論、分子病理基礎(chǔ)以及探索性實(shí)驗(yàn)證實(shí)大黃丹參合用抗胰腺纖維化的有效性，其可通過抑制ECM合成，促進(jìn)ECM降解，下調(diào)TGF-β1表達(dá)，抑制PSC活化來阻斷胰腺纖維化。CP在疾病發(fā)展過程中，除了有外分泌功能的改變，也伴隨內(nèi)分泌功能障礙。以往研究均著眼于大黃、丹參對(duì)胰腺纖維化本身的影響，本實(shí)驗(yàn)即是在上述研究基礎(chǔ)上，同時(shí)著眼于胰腺纖維化和其發(fā)展過程中糖代謝的變化，并觀察大黃丹參合用對(duì)二者的干預(yù)作用。

表1 各組大鼠血清LN、col-1、HA、FBG及Fin含量比較（±s）

表1 各組大鼠血清LN、col-1、HA、FBG及Fin含量比較（±s）

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

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4.2 α-SMA、col-1、LN及HA在胰腺纖維化發(fā)展過程中的作用及大黃丹參的干預(yù)作用 胰腺纖維化的本質(zhì)是ECM合成增多或者降解減少導(dǎo)致ECM沉積。α-SMA是由于各種原因?qū)е乱认俳M織發(fā)生炎癥或壞死而釋放的細(xì)胞因子激活PSC，繼而轉(zhuǎn)化為成纖維樣細(xì)胞而表達(dá)，標(biāo)志著胰腺纖維化的形成。col-1和LN作為ECM的主要成分，HA作為ECM的成分及ECM合成時(shí)的中間產(chǎn)物，在ECM合成增多過程中均扮演重要角色[14]。本研究結(jié)果顯示，在胰腺大體形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)方面，模型組均存在不同程度的病理變化，大黃丹參高、中、低劑量可以不同程度改善以上病理變化。同時(shí)，模型組α-SMA呈高表達(dá)，證實(shí)存在胰腺纖維化，大黃丹參高、中、低劑量均可不同程度下調(diào)α-SMA的表達(dá)。血清ELASA結(jié)果亦顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清LN、col-1及HA含量明顯增高，大黃丹參高、中、低劑量組LN含量較模型組明顯降低，大黃丹參高、中劑量組col-1含量較模型組明顯降低。提示大黃丹參合用在改善胰腺組織的病理變化及下調(diào)α-SMA表達(dá)的同時(shí)，還可以降低血清LN和col-1含量。

4.3 FBG及Fins在胰腺纖維化發(fā)展過程中的作用及大黃丹參的干預(yù)作用 胰腺纖維化過程中伴有內(nèi)分泌功能障礙，主要表現(xiàn)為血糖異常。胰島素是維持血糖穩(wěn)態(tài)的主導(dǎo)因素，當(dāng)胰島素分泌減少時(shí)，可導(dǎo)致糖耐量異常。同時(shí)，當(dāng)CP引起胰島纖維化和微循環(huán)障礙后，一方面導(dǎo)致生成的胰島素?zé)o法進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，另一方面還可影響β細(xì)胞對(duì)血液葡萄糖濃度的感知，導(dǎo)致胰島素分泌減少，隨后引起糖代謝異常[15-16]。國內(nèi)同行亦關(guān)注慢性胰腺炎并發(fā)內(nèi)分泌功能的障礙，并開展了部分研究。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，肝臟胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常是慢性胰腺炎致內(nèi)分泌功能障礙的重要環(huán)節(jié)[17]。還有學(xué)者認(rèn)為慢性胰腺炎胰腺內(nèi)分泌功能不全的主要機(jī)制是由于胰腺纖維化導(dǎo)致胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞及其他內(nèi)分泌細(xì)胞的破壞，繼而出現(xiàn)各種激素如胰島素紊亂而誘導(dǎo)糖耐量異?；蛱悄虿18]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清FBG含量明顯增高，F(xiàn)ins含量明顯降低。與模型組比較，大黃丹參高、中、低劑量組Fins含量顯著增高；大黃丹參低劑量組FPG含量顯著降低，中、高劑量組FPG含量有所下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，慢性胰腺炎模型大鼠在發(fā)生胰腺纖維化的同時(shí)，存在血糖升高及胰島素分泌減少而導(dǎo)致糖代謝發(fā)生異常?！敖档虵BG含量，升高Fins含量—降低col-1、LN含量—下調(diào)α-SMA表達(dá)—抑制ECM合成—改善ECM異常沉積”可能亦是大黃丹參合用抗胰腺纖維化的作用主線，其中涉及糖代謝異常的信號(hào)通路諸如腎素—血管緊張素系統(tǒng)（RAS）/Smad7在胰腺纖維化中的重要作用及大黃丹參的干預(yù)研究尚有待在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討。