但 丁，孫春平，陳浩宇,2，梁 路,2，徐 佳,2，張常娥,2**

(1.廣州醫(yī)科大學蛋白質修飾與降解實驗室，廣東 廣州 511436；2.廣州醫(yī)科大學病理生理學教研室)

腦血管疾病已成為首要危害人類生命與健康的常見病和多發(fā)病之一，其中最常見的是腦卒中，分為缺血性(腦梗死)和出血性(腦出血)腦卒中兩種類型，前者在臨床病例中約占70%以上。研究表明，腦卒中誘因復雜且多樣，多為可防控的后天性因素，如高血壓、糖尿病、血脂異常、吸煙、肥胖等[1]。隨著臨床溶栓療法的應用開展，發(fā)現(xiàn)因氧反常、pH反常、鈣反常等因素[2]，血流再灌注有時會加劇腦組織損傷。但恢復血流灌注是防止缺血腦組織進一步損傷的主要措施[3]，如何減輕這種矛盾性的問題，目前仍是該領域研究的熱點。

L-卡尼汀(L-carnitine，LC)[4]是機體內源性小分子，輔助線粒體內膜肉毒堿脂酰轉移酶，參與細胞內脂質β-氧化過程產生ATP，提供生命活動所需能量。研究表明LC有預防心肌缺血性損傷的作用。本課題組曾采用Zea-Longa[5]改良線栓法構建大鼠右側大腦中動脈腦缺血再灌注模型，對比研究了LC對大鼠局灶性腦缺血再灌注的預防和治療作用，發(fā)現(xiàn)LC對腦缺血再灌注性損傷有預防作用優(yōu)于治療效果。本實驗在前期的基礎上，進一步研究LC對腦缺血再灌注性損傷的預防機制，為闡明腦缺血再灌注損傷的預防或治療提供實驗依據，并為相關藥物開發(fā)提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器及型號

Denver instrument電子天平，Eppendorf 5810R型離心機，Leica 2000振蕩切片機，Olympus BX51型顯微鏡，尼康照相機，F(xiàn)LOKO勻漿器，Thermo全波長多功能酶標儀，Bio-Rad電泳-轉膜儀。

1.1.2 實驗動物及分組

3月齡SPF級成年雄性SD大鼠72只，體質量(260±20)g。由廣東省實驗動物中心提供，合格證號：44007200000384/440720929。隨機分成3組，每組24只，即假手術組(Sham組)、腦缺血再灌注組(I/R組)和L-卡尼汀預防組(LC組)。所有大鼠在廣州醫(yī)科大學動物中心正常飼養(yǎng)，室溫(24±1)℃，濕度正常，保持12h光照/12h黑暗的光照規(guī)律。

1.1.3 藥品與主要試劑

LC購自Sigma公司，DAB顯色液購自南京建成生物工程研究所，大鼠白細胞介素IL-1β及腫瘤壞死因子TNF-α的ELISA檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，Bax和Bcl-2等抗體購自CST公司。其它試劑均為進口分裝或國產化學分析純。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦缺血再灌注(I/R)損傷模型的復制

根據Zea-Longa法進行改良，利用線栓復制大鼠右側大腦中動脈腦缺血再灌注模型。具體手術操作方法及實驗要求參照文獻[6]。

1.2.2 LC藥物的注射[6]

LC采用生理鹽水配置成20mg/mL濃度，4℃儲存?zhèn)溆?。Sham組與I/R組，大鼠在I/R手術操作前2h和再灌注前2h腹腔注射生理鹽水；LC預防組大鼠在相同時間點注射LC，劑量為200mg/kg。

1.3 檢測指標

1.3.1 腦梗死體積的測量

根據改良Longa線栓法進行大鼠大腦中動脈缺血2h再灌注24h后，對所有大鼠進行進行神經行為學評分，以確定腦缺血再灌注模型是否成功，具體結果參見本課題組前期報道的文獻[6]。每組隨機取6只大鼠進行腦梗死體積的測量，具體操作和計算方法與文獻[6]一致。

1.3.2 血清及腦組織炎癥介質測定

所有大鼠用10%水合氯醛麻醉后，開胸經左心室取血，室溫靜置2h后，如果有溶血現(xiàn)象就不納入，4℃ 3000r/min離心10min，分離血清，-20℃儲存待測。大鼠取血后，斷頭取腦，冰生理鹽水漂洗，分離右側大腦皮質，用生理鹽水制成10%腦組織勻漿，4℃，10000g離心10min，取上清液，-20℃凍存待測。ELISA法檢測血清及腦組織中的TNF-α和IL-1β含量，操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.3 腦水腫含量測定

每組取6只大鼠斷頭后取出全腦，去掉嗅球腦干和小腦，沿正中矢狀線分開左右兩側腦半球，右側腦組織生理鹽水洗凈并濾紙吸干，稱腦組織濕重后，置于60℃電熱恒溫鼓風干燥箱中，烘干2～3d，待腦組織恒重后稱其干重，計算腦組織含水量。含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.4 腦組織形態(tài)學檢測

每組取3只大鼠，4%多聚甲醛灌流固定后，取出全腦組織后固定24h。切取顳葉對應全腦區(qū)域，進行連續(xù)震蕩冠狀切片，厚度為20μm，置于含0.05% NaN3的0.1M PB緩沖液鹽溶液中，4℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。每只大鼠?片切片，梯度酒精脫水，尼氏染色，常規(guī)透明、封片，光鏡下觀察組織病理改變并拍照分析。

1.3.5 免疫組化檢測

上述每只大鼠腦組織連續(xù)切片中，每隔5片取1片，每只共取5片，用ABC法進行Bax和Bcl-2的免疫組織化學染色，DAB顯色，后續(xù)拍照并進行灰度OD值分析。

1.3.6 Western-Blot檢測

每組取3只大鼠取血后，斷頭取腦，冰生理鹽水漂洗，分離右側顳葉皮質。用蛋白裂解液提取腦組織蛋白，蛋白勻漿提取液置于-20℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。BCA法測定組織蛋白含量，Western-Blot檢測腦組織Bax和Bcl-2的表達量，并進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 腦梗死體積結果

大鼠經過缺血2h再灌注24h后，每組取6只全腦進行TTC染色。I/R組所有大鼠右側大腦皮層出現(xiàn)大面積梗死灶。通過Image J圖形處理軟件對梗死灶計算：假手術組無梗死，I/R組梗死灶體積百分比約為(34.50±4.32)%，兩組比較差異有非常顯著性(P<0.01)；用LC預防后，大鼠腦梗死體積顯著減少，平均為(11.13±3.13)%，與I/R組比較差異有非常顯著性(P<0.01)，見圖1(封二)。

2.2 大鼠血清及腦組織炎癥介質變化

大鼠經右側大腦中動脈缺血2h再灌注24后，ELISA檢測血清和腦組織炎癥介質IL-1β及TNF-α含量。結果顯示：I/R組血清和腦組織IL-1β及TNF-α含量上升，與Sham組比較有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。LC預處理能顯著降低血清和腦組織炎癥介質IL-1β及TNF-α含量，LC組與I/R組比較差異有顯著性(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清、腦組織炎癥介質及腦含水量變化

2.3 大鼠腦組織含水量變化

缺血再灌注損傷引起腦組織含水量增加及水腫。大鼠經過右側大腦中動脈缺血2h再灌注24h后，取出腦組織，肉眼觀察可見I/R組大鼠右側腦組織因明顯的水腫導致體積增大，顳葉區(qū)出現(xiàn)缺血性灰白色變化；LC組大鼠經過2次LC 200mg/kg注射后，腦組織水腫和顏色變化程度比I/R組大鼠明顯減輕。腦組織經過60℃烘烤，分析和計算其濕重和干重之比，發(fā)現(xiàn)I/R組大鼠腦組織含水量顯著增加，與Sham組比較有顯著性差異(P<0.05)，經LC預處理后，腦組織含水量顯著減少，與Sham組比較差異無顯著性(P>0.05)，與I/R組比較差異具有顯著性(P<0.05)，見表1。

2.4 尼氏染色結果

每組選取3只大鼠，每只選取3片進行尼氏染色。普通光鏡下，尼氏小體為紫色。右側顳葉皮質神經元的尼氏結果顯示：Sham組尼氏小體染色均一，神經元結構完整，排列整齊，無壞死，細胞間隙致密無水腫。I/R組神經元數量顯著減少，排列紊亂，神經元胞體變小，尼氏小體減少，胞質染色變淺或濃縮，胞核出現(xiàn)固縮、碎裂或溶解等。LC組大部分神經元細胞結構完整，部分細胞存在腫脹，可見散在的壞死組織，細胞間輕微水腫。見圖2(封二)。

2.5 大鼠腦組織Bax和Bcl-2的變化

每只大鼠選取5片腦組織切片，用Bax和Bcl-2抗體進行免疫組化染色，拍照進行分析。Bax抗體的免疫組化結果顯示：Sham組大鼠腦皮質神經元結構清晰完整，細胞排列密集整齊，細胞漿無棕色染色，細胞核居中，核仁清楚；I/R組大腦皮層顳葉部位神經元數量減少，神經元結構紊亂，排列不整齊，大部分神經元可見深棕色染色，部分區(qū)域出現(xiàn)核固縮、碎裂、細胞溶解等壞死現(xiàn)象，間質水腫嚴重，經脫水后出現(xiàn)大量的空洞。LC組可見部分神經元呈現(xiàn)淺棕色染色，神經元結構排列較整齊，細胞核比較完整，可見少量神經元損傷和壞死現(xiàn)象，間質存在少量水腫。Bcl-2抗體的免疫組化染色結果與Bax相反，神經元的結構排列和損傷則相類似。見圖3(封二)。

每組隨機選取3只大鼠右顳葉皮質，用組織蛋白裂解液制成10%的腦組織勻漿，Western-blotting法檢測腦組織Bax和Bcl-2的變化。結果顯示：與Sham組比較，I/R組腦組織Bax表達量顯著增多，Bcl-2表達則顯著性減少，經灰度分析兩組有顯著性差異(分別為P<0.01，P<0.05)；而用LC預防后，顯著性改變了上述Bax和Bcl-2在腦組織中的表達水平。見圖4。

A.Western-blotting法檢測腦組織Bax和Bcl-2結果；B.Western-blotting法檢測腦組織Bax和Bcl-2結果相對灰度值(與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01；與I/R組比較，△P<0.05；n=3)

3 討 論

在臨床腦血管病中，缺血性腦血管病具有高發(fā)病率、致殘率及死亡率的特點，是人類三大死亡原因之一[7]，給社會和家庭帶來了沉重的經濟負擔。腦缺血超過一定時限后發(fā)生缺血性損傷，嚴重時出現(xiàn)腦梗死，恢復缺血腦組織的血流是防止腦梗死的必要措施。臨床研究指出，灌注液的流量、Na+/Ca2+比值、pH值及線粒體膜的穩(wěn)定性[8]等多種條件均能影響I/R所引起的損傷程度。因此，預防腦缺血后再灌注引起的后續(xù)損傷在腦卒中防治方面具有重要意義。

LC在機體內主要提高組織器官脂肪酸代謝水平[4]。據報道[9]：LC能促進心肌細胞能量代謝，降低Ca2+超載水平，對心肌缺血再灌注損傷有一定的預防和治療作用。LC在腎臟中也能促進脂肪酸氧化供能過程[10]，但較少報道LC在腦組織中的作用。本課題組曾報道[6]，大鼠右側大腦中動脈線栓法構建腦缺血再灌注模型，缺血2h后拔出線栓，大腦中動脈血流由大腦前動脈供應恢復再灌注，大鼠出現(xiàn)嚴重皮質神經元損傷，右眼瞼肌張力下降，無法直線行走，出現(xiàn)咬尾或轉圈現(xiàn)象；恢復血液灌注24h后，大鼠的行為表現(xiàn)持續(xù)存在。經檢測血漿和腦組織各項指標檢測發(fā)現(xiàn)：對比I/R組，LC組腦組織中ATP含量顯著升高，血漿和腦組織中SOD活力增加，MDA的含量下降。這些結果說明LC預防性給藥后，大鼠腦組織能量代謝水平和抗氧化能力增強，這可能是LC預防大鼠腦I/R損傷的部分機制。

為了探討LC預防大鼠腦缺血再灌注性損傷是否存在其它機制，本實驗在前期動物模型和給藥方法的基礎上，做了進一步研究。發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血再灌注24h后，I/R組大鼠腦組織炎癥反應和含水量顯著增加，尼氏染色和免疫組化結果顯示：梗死灶的中央區(qū)域有大量的細胞壞死溶解，部分細胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征， Western-blotting結果進一步證實腦組織促凋亡相關蛋白Bax表達增多，而抑凋亡相關蛋白Bcl-2減少。這些結果說明了大鼠局灶性腦缺血后，腦組織缺血缺氧引起的組織損傷，并不能因為血液再灌注而改善，反而容易觸發(fā)炎癥反應導致腦水腫，增加神經元凋亡程度，表明再灌注加重大鼠腦組織的缺血性損傷。LC組通過腦缺血前2h和再灌注前2h分別腹腔注射200mg/kg的LC，相比于I/R組，腦組織的炎癥反應和水腫輕度明顯減輕，尼氏染色和免疫組化結果均表明LC組腦間質水腫及梗死區(qū)域減輕，凋亡神經元減少，WB顯示促凋亡蛋白Bax表達水平減少，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達升高。上述結果表明LC有抗炎、減輕腦組織水腫和抗凋亡作用，從而進一步闡明了LC預防大鼠腦缺血再灌注性損傷的機制。

綜合本課題組的研究發(fā)現(xiàn)可以闡明：LC對腦缺血再灌注性損傷的預防機制可涉及到提高能量代謝、抗氧化、抗炎、抗水腫和抗凋亡等幾個方面。至于LC預防腦缺血再灌注損傷更深層的分子生物學機制，如代謝相關通路的激活以及其調控凋亡相關通路的方式，尚需要進一步研究來闡明。本研究可以為臨床上LC預防腦缺血再灌注損傷提供一定實驗依據，為LC是否可以作為腦缺血的治療藥物提供一定理論指導。