馬徐民，羅斌華，胡美純，王 華**

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是高發(fā)病率、高死亡率的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病之一[1]。由于惡性程度高、諸多藥物無(wú)法透過(guò)血腦屏障等特點(diǎn)，目前對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療方法十分有限。并且，膠質(zhì)瘤對(duì)放化療等治療手段的耐受性較強(qiáng)，導(dǎo)致治療效果差，且治療后易復(fù)發(fā)，患者中位生存期較短[2]，因此，尋求一類(lèi)有效的治療藥物已迫在眉睫。與傳統(tǒng)藥物相比，小分子具有副作用小、特異性高且能夠透過(guò)血腦屏障等優(yōu)勢(shì)，是目前神經(jīng)膠質(zhì)瘤藥物治療的研究熱點(diǎn)[3]。小檗堿(berberine)是從黃連植物的根莖中提取出的一種小分子活性物質(zhì)，又稱(chēng)作黃連素，是一種異喹啉生物堿，臨床上作為一類(lèi)降糖中藥用于糖尿病的治療；它對(duì)細(xì)菌性腸炎、惡性腫瘤也有較好的效果[4-6]；對(duì)乳腺癌、鼻咽癌、宮頸癌等諸多惡性腫瘤都有明顯抗腫瘤活性[7-9]，作用機(jī)制可能與p53、Bcl-2蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路有關(guān)。但是，小檗堿在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制卻鮮有報(bào)道。CDK2是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是真核生物中細(xì)胞分裂周期的重要調(diào)控因子。體內(nèi)CDK2水平的增高被認(rèn)為與腫瘤患者預(yù)后差相關(guān)，這導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖不可控[10]。目前CDK2是腫瘤藥物篩選的潛在靶點(diǎn)，基于CDK2靶點(diǎn)篩選到的小分子以及多肽藥物已經(jīng)進(jìn)入到臨床試驗(yàn)中。通過(guò)分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，小檗堿能和CDK2的ATP結(jié)合區(qū)域結(jié)合。而且小檗堿能夠抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移以及克隆形成，下調(diào)腫瘤細(xì)胞CDK2水平。本文通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，研究深入分子機(jī)制層面，為小檗堿治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床藥理作用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞：鼠源腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6由羅斌華教授饋贈(zèng)。主要試劑：小檗堿購(gòu)自Solarbio公司，青鏈霉素、兩性霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，MTT試劑購(gòu)自碧云天生物公司，過(guò)硫酸銨(APS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)購(gòu)自Sigma公司，胰蛋白酶、Loading buffer(5X)、ECL發(fā)光試劑盒、DMSO、MTT試劑、預(yù)染蛋白Marker購(gòu)于碧云天生物公司，脫脂奶粉購(gòu)于美國(guó)BD公司、PVDF膜購(gòu)于美國(guó)Millipore公司，甘油、甲醇購(gòu)于武漢中天化工公司，抗體均購(gòu)于A(yíng)Bclonal。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)小檗堿對(duì)C6細(xì)胞增殖的抑制作用

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至5000個(gè)/孔，邊緣孔用無(wú)菌PBS填充。5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿(mǎn)孔底，加入濃度梯度的藥物，細(xì)胞貼壁后即加藥，前一天下午鋪板，次日上午加藥，5%CO2，37℃孵育72h。每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液后每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值間接反映活細(xì)胞數(shù)目，以小檗堿濃度0μmol/L為對(duì)照組，其他所有實(shí)驗(yàn)均按此原則進(jìn)行。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD-對(duì)照組OD)/(對(duì)照組OD)，設(shè)定對(duì)照組存活率為1。實(shí)驗(yàn)組存活率與之相比，若存活率小于1則藥物對(duì)細(xì)胞有抑制增殖作用；若大于1，藥物對(duì)細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后將數(shù)據(jù)整理利用Graphpad prism軟件進(jìn)行作圖分析。

1.2.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)試藥物對(duì)C6細(xì)胞遷移的抑制作用

先用marker筆在6孔板背面用直尺劃線(xiàn)，每孔4條橫線(xiàn)，每孔加入5×105個(gè)細(xì)胞待貼壁。待細(xì)胞密度達(dá)到100%時(shí)用黃色移液器槍頭平行于背面的marker印跡劃?rùn)M線(xiàn)，用無(wú)菌PBS緩沖液清洗細(xì)胞3遍。分別加入不同濃度(0、1、5、10、25、50μmol/L)小檗堿，設(shè)陰性對(duì)照組。當(dāng)對(duì)照組細(xì)胞遷移滿(mǎn)后，實(shí)驗(yàn)停止，4%多聚甲醛固定細(xì)胞后拍照。Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)量和計(jì)算，細(xì)胞遷移率=(0h劃痕寬度-培養(yǎng)后劃痕寬度)/0h劃痕寬度×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后將數(shù)據(jù)整理利用Graphpad prism軟件進(jìn)行作圖分析。

1.2.3 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)小檗堿對(duì)C6細(xì)胞克隆形成的抑制作用

將細(xì)胞狀態(tài)較好并處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6細(xì)胞，胰酶消化1～2min，1000rpm離心棄上清液，細(xì)胞計(jì)數(shù)。每孔2000個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中，隔天給藥后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d左右。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，用PBS清洗細(xì)胞2次。加4%多聚甲醛固定液5mL固定細(xì)胞15min，去固定液，加適量結(jié)晶紫染色液染10～30min，用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，最后計(jì)算克隆形成率，Image J軟件計(jì)數(shù)并作圖分析，克隆形成率(對(duì)照組)=實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/對(duì)照組克隆數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后將數(shù)據(jù)整理利用Graphpad prism軟件進(jìn)行作圖分析。

1.2.4 免疫蛋白印跡法(Western Blot)檢測(cè)小檗堿作用后CDK2的表達(dá)水平

小檗堿處理C6細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞裂解提取總蛋白。具體方法：去除培養(yǎng)基，用PBS涮洗，每皿加入50μL細(xì)胞裂解液(其中含有Cocktail、PMSF、NaVO3)，并使培養(yǎng)皿傾斜放入冰中10min使細(xì)胞裂解充分，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5mL EP管中，使用冷凍高速離心機(jī)在4°C的條件下離心(12000rpm，10min)后將沉淀?xiàng)壍簦锨逡杭礊榧?xì)胞總蛋白。利用BCA法測(cè)蛋白濃度，一抗4°C過(guò)夜，二抗常溫孵育1h，自動(dòng)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)讀取結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后分析結(jié)果。

1.2.5 小檗堿與CDK2計(jì)算機(jī)模擬

本文采用Autodock Tool[11]進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬。受體分子CDK2蛋白質(zhì)是從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載得到(PDB ID：2EXM)，剔除原有結(jié)構(gòu)中的配體和水分子。配體分子小檗堿由Chem Bio Office繪制并轉(zhuǎn)換成pdb文件；受體分子經(jīng)過(guò)加氫加電荷等處理后，設(shè)定Gridbox，進(jìn)行格點(diǎn)計(jì)算得到格點(diǎn)文件；最后，將小檗堿與受體分子進(jìn)行分子對(duì)接，得到10個(gè)不同的分子構(gòu)象。通過(guò)文獻(xiàn)中其他小分子抑制劑比對(duì)以及10個(gè)分子構(gòu)象結(jié)合自由能參數(shù)分析，最終確定分子對(duì)接的最佳構(gòu)象。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用Graphpad prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并繪圖，組間差異采用單因素方差分析，P<0.05可說(shuō)明結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 小檗堿抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及克隆形式

與對(duì)照組相比，小檗堿能夠明顯抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力(圖1～2，封三)。隨著小檗堿濃度的升高，C6細(xì)胞的增殖活力明顯下降(圖1A，封三)，當(dāng)小檗堿濃度達(dá)到5μmol/L時(shí)，腫瘤細(xì)胞間隙增加，部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞存活率下降約25%。而在濃度為25μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率僅為50%。當(dāng)濃度達(dá)到最大給藥濃度50μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率下降了75%左右(圖1B，封三)，這說(shuō)明小檗堿對(duì)C6腫瘤細(xì)胞具有明顯的殺傷效果。

在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，不同濃度小檗堿處理C6細(xì)胞72h后，腫瘤細(xì)胞克隆形成率隨藥物濃度的升高也呈下降趨勢(shì)(圖2A，封三)。當(dāng)濃度為5μmol/L時(shí)，細(xì)胞克隆形成率僅為50%。而當(dāng)濃度為50μmol/L時(shí)，其克隆形成率為10%以下(圖2B，封三)。因此，小檗堿能夠有效抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移及克隆形成能力。

2.2 小檗堿能夠抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力

細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)所示如圖3A(封三)所示，當(dāng)藥物處理48h后，對(duì)照組細(xì)胞已遷移滿(mǎn)，實(shí)驗(yàn)停止，固定細(xì)胞后進(jìn)行拍照。和對(duì)照組相比，在相同給藥時(shí)間下，C6細(xì)胞的遷移能力隨著藥物濃度的增高呈下降趨勢(shì)。在給藥12h，當(dāng)小檗堿濃度為25μmol/L時(shí)，C6細(xì)胞的遷移能力降低約40%，在濃度為50μmol/L時(shí)，遷移能力可以降低80%以上(圖3B，封三)。因此，小檗堿能夠顯著抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力。

2.3 小檗堿下調(diào)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞CDK2蛋白表達(dá)水平

不同濃度的小檗堿處理C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞72h后，利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)CDK2蛋白的表達(dá)，CDK2蛋白隨著小檗堿濃度的增高而下降(圖4A)。對(duì)Western Blot條帶結(jié)果所進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，藥物濃度為10μmol/L時(shí)，CDK2的蛋白已下降50%以上(圖4B)。因此，小檗堿可下調(diào)C6細(xì)胞CDK2蛋白的表達(dá)。

A.不同濃度小檗堿可下調(diào)CDK2蛋白表達(dá)水平；B.Western Blot結(jié)果灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=3，與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.4 小檗堿結(jié)合于CDK2的ATP結(jié)合區(qū)域

通過(guò)計(jì)算模擬發(fā)現(xiàn)，小檗堿與CDK2的ATP結(jié)合區(qū)域結(jié)合(圖5B)。結(jié)合文獻(xiàn)以及分子構(gòu)象結(jié)合自由能最低原則，在分子對(duì)接得到的10個(gè)構(gòu)象中，第8個(gè)構(gòu)象是最優(yōu)構(gòu)象，其結(jié)合自由能為-7.71(表1)。CDK2中的疏水氨基酸Leu134、Phe80、Phe82、Val18和Ile10形成的疏水口袋將berbine錨定在A(yíng)TP結(jié)合口袋中。并且，CDK2的極性氨基酸Asp145和Lys33側(cè)鏈能夠與小檗堿的甲氧基中的氧氫鍵結(jié)合，而His84與小檗堿喹嗪環(huán)中的兩個(gè)O具有氫鍵相互作用(圖5C)。并且，與其他CDK2小分子抑制劑的三級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，小檗堿的空間構(gòu)象與其他小分子類(lèi)似，均是通過(guò)Leu134、Phe80、Phe82、Val18以及Ile10形成的疏水作用以及Asp145和Lys33形成的氫鍵作用進(jìn)行結(jié)合(圖5D)。因此，疏水作用和氫鍵相互作用在berbine與CDK2的結(jié)合中起著重要作用。通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬，可以為小檗堿靶向CDK2抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)提供理論依據(jù)。

A.CDK2蛋白晶體結(jié)構(gòu)，其N(xiāo)端具有ATP結(jié)合區(qū)域(PDB ID：2EXM)；B.小檗堿與CDK2的ATP區(qū)域結(jié)合；C.小檗堿位于Leu134、Ile10、Phe80和Phe82形成的疏水口袋中，并與Asp145、Lys33以及His84具有氫鍵結(jié)合作用；D.小檗堿與其他CDK2小分子抑制劑的分子構(gòu)象比對(duì)(PDB ID：1PYE，2DUV，2EXM，2VV9，3MY5)

表1 小檗堿與CDK2分子對(duì)接的分子構(gòu)象結(jié)合自由能及RMSD值

3 討 論

與傳統(tǒng)藥物相比，小分子靶向藥物對(duì)其所針對(duì)的腫瘤具有較為突出的療效，并且有耐受性好、毒性反應(yīng)較輕、可通過(guò)血腦屏障等優(yōu)勢(shì)[12]。小檗堿作為一種異喹啉生物堿，在自然界分布廣，有著良好的開(kāi)發(fā)優(yōu)勢(shì)。腫瘤是由環(huán)境、遺傳、營(yíng)養(yǎng)和飲食等多種不同因素相互作用引起的一類(lèi)嚴(yán)重疾病，傳統(tǒng)臨床上針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療多采用手術(shù)切除并輔助放化療，但是由于放化療對(duì)正常細(xì)胞同時(shí)具有殺傷作用，副作用較大，通常治療后常并發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)。目前在臨床上已經(jīng)廣泛使用的小分子靶向藥物，例如伊馬替尼、吉非替尼分別在慢性粒細(xì)胞白血病(CML)急變期與轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌都已取得顯著效果[13]。分子靶向性藥物的研究必定會(huì)有力的推動(dòng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤在臨床上的治療進(jìn)程。

C6是一株高度惡性的鼠源神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，常用作膠質(zhì)瘤研究的細(xì)胞模型。CDK2蛋白的異常高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其在細(xì)胞周期信號(hào)通路中是起著關(guān)鍵作用的蛋白之一，以CDK2蛋白為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)抗腫瘤藥物已經(jīng)成為藥物的研究與開(kāi)發(fā)的重要方向。本文分子對(duì)接結(jié)果顯示，小檗堿能夠與CDK2的ATP結(jié)合區(qū)域結(jié)合，并且，實(shí)驗(yàn)證實(shí)小檗堿對(duì)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移與克隆形成均具有抑制作用；Western Blot結(jié)果顯示，小檗堿通過(guò)下調(diào)CDK2對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起抑制作用。結(jié)合小檗堿分子對(duì)接結(jié)果，我們推測(cè)，小檗堿很有可能是靶向CDK2，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制ATP的結(jié)合，從而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)。然而，這些分子機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

總而言之，本研究把計(jì)算機(jī)模擬與實(shí)驗(yàn)研究相結(jié)合，在細(xì)胞層面證實(shí)小檗堿對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起抑制作用，并研究小檗堿對(duì)腫瘤細(xì)胞中CDK2蛋白表達(dá)的影響，這為小檗堿對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供了理論依據(jù)，為小分子藥物小檗堿成為抗腫瘤靶向性藥物奠定了基礎(chǔ)。