朱永生 徐靖 蔣家煥 鄭燕梅 陳麗萍 蔡秋華 王愛榮 張建福

摘要：[目的]葉片早衰影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，早衰突變體是研究水稻衰老機(jī)制的良好載體，鑒定、分析早衰突變體的表型特征，有助于了解突變體的遺傳規(guī)律，為相關(guān)基因的克隆和功能研究奠定基礎(chǔ)。[方法]人工接種鑒定了早衰突變體wl4的稻瘟病和水稻白葉枯病抗性，同時(shí)通過對離體葉片的黑暗誘導(dǎo)和葉綠素含量測定，鑒定了突變體wl4的早衰表型;再分別對早衰突變體w14和野生型梗稻品種云引（簡稱'YY'）中水稻早衰相關(guān)基因和病程相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析，研究早衰突變體wl4的早衰類型及與野生型在防御系統(tǒng)上的差異。[結(jié)果]黑暗誘導(dǎo)處理24h后，突變體w14的葉綠素含量顯著低于野生型YY（P《0.05）。黑暗誘導(dǎo)處理48h以上，突變體wl4的葉綠素含量極顯著低于野生型YY（P《0.01）。突變體wl4中衰老相關(guān)基因sGR、Osh36、Osh69、PAO、NYC3和RCCRl的表達(dá)均顯著高于野生型YY。分別接種水稻白葉枯和稻瘟病后，突變體wl4均表現(xiàn)為比野生型YY更感病，且病程相關(guān)基因PRla、PR4、CthI、PR1b、PBZ1、PR3等的表達(dá)在突變體中顯著上調(diào)。[結(jié)論]突變體wl4具有典型的衰老和感稻瘟病、水稻白葉枯病的表型，與野生型相比，在突變體中與病程相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著改變，即突變體防御系統(tǒng)的改變導(dǎo)致其出現(xiàn)感病的表型。

關(guān)鍵詞：水稻;突變體;早衰;葉綠素;抗病性;基因表達(dá)

中圖分類號：S511

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-0384（2020）06-0626-07

0引言

[研究意義]水稻是單子葉模式植物，也是全世界最主要的糧食作物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，水稻等禾谷類作物的產(chǎn)量95%來自葉片光合作用。水稻功能葉一旦在其灌漿的中后期出現(xiàn)早衰，將極大影響到種子發(fā)育過程中的糖類和其他碳水化合物的積累，從而對產(chǎn)量和品質(zhì)均造成較大的影響。通過深人研究水稻葉片早衰的分子機(jī)理，特別是水稻發(fā)生早衰后的一些重要性狀的遺傳和生理特性的變化，不僅可以從分子水平闡釋植物的生長發(fā)育和衰老的規(guī)律，探尋可行的延緩植物衰老的方法，也能通過基因工程等手段調(diào)控影響水稻重要性狀（如抗病性等）的基因，對培育抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)水稻新品種具有重要的應(yīng)用價(jià)值。[前人研究進(jìn)展]衰老是植物生長發(fā)育的最后一個階段，同時(shí)受到遺傳基因與外界環(huán)境的影響。在植物衰老過程中，葉片等器官中的營養(yǎng)物質(zhì)會轉(zhuǎn)移到生殖器官，這是植物在漫長的進(jìn)化過程中建立的一種自我保護(hù)形式。后時(shí)，植物的自然衰老也可提高對環(huán)境的適應(yīng)能力，是其生長發(fā)育的重要生命歷程。目前的研究結(jié)果表明，植物衰老是一個較為復(fù)雜的生命過程，涉及多種代謝途徑”。近年來，通過基因定位與克隆、全基因組分析等方法，已構(gòu)建了植物衰老分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的部分結(jié)構(gòu)，但其復(fù)雜的內(nèi)在機(jī)理還不夠明晰。植物葉片衰老除了受到環(huán)境因素，如受光、溫、千旱、鹽堿等各種非生物脅迫因素的影響外，也受脫落酸、乙烯、細(xì)胞分裂素等植物自身激素的調(diào)節(jié)。從植物葉片早衰數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果顯示，在水稻中已鑒定出150多個與葉片衰老相關(guān)的基因，其中經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證或互補(bǔ)驗(yàn)證的與葉片早衰相關(guān)的調(diào)控基因僅有50多個。在其中21個已克隆的水稻葉片早衰相關(guān)基因中，多數(shù)基因參與激素合成及信號傳導(dǎo)、葉綠素降解、過氧化反應(yīng)四及逆境脅迫叫等途徑。這些研究結(jié)果顯示，早衰突變體多數(shù)是因?yàn)橹参锟寡趸到y(tǒng)功能下降，導(dǎo)致葉片衰老。因此，早衰突變體往往與某些防御反應(yīng)相關(guān)基因存在一定的聯(lián)系，在植物防御機(jī)制中也具有重要的調(diào)控作[1]擬南芥hysl（hypersenescence 1）突變體在暗誘導(dǎo)條件下表現(xiàn)出早衰癥狀，而同時(shí)HYSl基因也是病程相關(guān)基因以，在該突變體表現(xiàn)早衰癥狀的同時(shí)，出現(xiàn)了防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)的表型，證明某些植物的早衰癥狀與防御反應(yīng)具有相同的遺傳基礎(chǔ)。[本研究切人點(diǎn)]目前，對早衰或者類病斑突變體的研究主要是通過遺傳學(xué)方法克隆相關(guān)基因后從生理生化的角度解釋造成植物早衰的分子機(jī)理，而從植物病程相關(guān)基因的表達(dá)差異與其防御系統(tǒng)的相關(guān)性研究鮮見報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問題]本研究通過對水稻早衰突變體w14進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查、相關(guān)生理指標(biāo)及病程相關(guān)基因的表達(dá)分析，以期明確早衰突變體與野生型YY之間存在的主要表型差異，為下一步遺傳群體的構(gòu)建、遺傳學(xué)分析和基因功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1水稻品種野生型品種云引（YY）由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，本研究所用的早衰突變體wl4由野生型品種YY經(jīng)0.8%EMS誘變處理后，經(jīng)多代篩選、鑒定直至自交穩(wěn)定而獲得;普感品種麗江新團(tuán)黑谷（LTH）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。

1.1.2菌株用于稻瘟病抗性鑒定的24個稻瘟病菌生理小種由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，用于水稻白葉枯病抗性鑒定的菌株浙173、C5等均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.2主要試劑

MES，購自國藥公司;植物總RNA提取試劑Trizol，購自全式金生物技術(shù)有限公司;cDNA鏈反轉(zhuǎn)試劑盒（ReverAidFirstStrandcDNASynthesisKit），購自Fermentas公司;熒光定量試劑盒RoxReferenceDyII（50X），購自羅氏（Roche）公司;2XPowerPfuPCRMasterMix，購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

13.1田間種植和表型觀察混收經(jīng)化學(xué)誘變的M代種子，均勻播種于秧田，待秧齡28d后移栽。本田的肥力中等偏上，田間種植規(guī)格：23cmX23m，每行插7株，每10行中按相同規(guī)格移裁1行同時(shí)播種的野生型對照。按照常規(guī)大田的水肥和病蟲害管理。分別于移栽后30d、60d、90d和120d觀察并記載M，代植株的表型，選擇有典型衰老表型的單株掛牌標(biāo)記，單株收種，套袋自交加代繁殖直至穩(wěn)定。

13.2水稻離體葉片抗衰老及葉綠素含量測定

別將野生型和突變體分蘗盛期的劍葉剪成1cm左右的小段，將剪斷的葉片葉脈朝下放置在0.3mol-L的MES溶液的培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋，放置于相對濕度90%、溫度25C的人工氣候箱連續(xù)96h黑暗培養(yǎng)，期間分別于24、48、72、96h進(jìn)行離體葉片衰老表型的觀察，并拍照記錄結(jié)果。葉綠素含量測定按照南京建成葉綠素含量測定試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.3稻瘟病抗性鑒定和調(diào)查分別將野生型和突變體種子播種于溫室內(nèi)秧盤，以普感稻瘟病品種麗江新團(tuán)黑谷（LTH）為對照，播種量為20粒左右，3次重復(fù)。接種前一周澆施2%尿素1次，使秧苗葉色濃綠、葉片下垂，待秧苗長至3葉1心時(shí)，洗脫和制備稻瘟病菌孢子懸浮液（孢子濃度調(diào)整至每亳升1X10個），加入吐溫20至終濃度0.25%o，使用人工噴霧接菌，保溫保濕7d后調(diào)查并記載發(fā)病情況，調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)按照國際水稻研究所制定的分級標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.4水稻白葉枯病抗性鑒定和調(diào)查從超低溫冰箱取出甘油菌，在NA培養(yǎng)基上活化后備用。待接種水稻長至分蘗盛期，通過剪葉法對水稻最上層完全展開的葉片進(jìn)行接種。將浙173、C5菌株分別配制成菌液濃度為oDBo0mm=0.5，等體積混勻后接種。接種后15d左右調(diào)查和記載發(fā)病情況，按照Gu等叫的調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.3.5水稻葉片RNA提取及反轉(zhuǎn)錄RNA提取參照Trizol試劑盒提供的方案進(jìn)行操作。提取的RNA經(jīng)NANODROP2000C測定檢測其質(zhì)量（A260：280=2.0左右，且A260：2301.8），同時(shí)經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。隨后將質(zhì)量合格的RNA進(jìn)行65C熱變性5min后，立即置于冰上冷卻，再按照逆轉(zhuǎn)錄

試劑盒操作說明，清除gDNA后再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，稀釋20倍后于-20C保存?zhèn)溆谩?/p>

13.6熒光定量PCR以水稻肌動蛋白基因Actin為內(nèi)參基因，進(jìn)行SYBRGreenI熒光定量PCR，反應(yīng)體系參照試劑盒說明書操作。抗病相關(guān)基因OsJARl、OsAOS2、CEBiP、Chtl、OsPAL1、OsPAL2、PR3、PR4、PRS和PBZI的熒光定量PCR引物序列參照文獻(xiàn)[15]的方法，水稻衰老相關(guān)基因SGR、Osh36、Osh69、PAO、NYC3和RCCRI的熒光定量PCR引物序列參照文獻(xiàn)[6]、[16]的方法。反應(yīng)在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5C，10min;95C、l5s，60C、60s，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，熔解曲線按照ABI7500儀器標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。最后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，并采用Excel2007進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2結(jié)果與分析

2.1突變體wl4的早衰表型鑒定

對突變體wl4和野生型YY進(jìn)行全生育期表型觀案，發(fā)現(xiàn)突變體自分蘗盛期開始，基部倒二、倒三葉開始出現(xiàn)明顯的衰老表型，表現(xiàn)為葉片褪綠、萎蔫、卷曲。為了進(jìn)一步驗(yàn)證早衰突變體與野生型的差異，分別對分蘗初期突變體（未出現(xiàn)明顯衰老表型）和野生型的離體葉片進(jìn)行人工黑暗誘導(dǎo)處理，結(jié)果顯示：處理前和處理24h時(shí)，突變體和野生型表型上并無顯著差異;處理48h時(shí)，突變體開始出現(xiàn)較為明顯的褪綠表型，而此時(shí)的野生型僅有輕微的褪綠;處理72h時(shí)，突變體衰老表型更為典型，葉綠素降解加速，野生型開始出現(xiàn)褪綠;至處理96h時(shí)，突變體兒乎完全失綠，衰老表型明顯，野生型尚有明顯的綠色部分（圖1-a）。

各個處理階段葉綠素含量的測定結(jié)果與表型結(jié)果相一致，未處理前野生型和突變體葉綠素含量無顯著差異;處理24h時(shí)，突變體葉片中葉綠素含量（葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的總含量，下同）比野生型降低了5.43%，差異顯著（P《0.05）;處理48h時(shí)，突變體葉片中葉綠素含量比野生型降低20.00%，差異極顯著（P《0.01）;處理72h和96h時(shí)，突變體葉片中葉綠素含量比野生型分別降低40.41%和78.97%，差異均達(dá)到極顯著水平（P《0.01）（圖1-b）。試驗(yàn)結(jié)果表明，在人工黑暗誘導(dǎo)處理?xiàng)l件下，突變體葉綠素降解更快，更易衰老。

2.2突變體wl4的抗病性鑒定

眾多有關(guān)水稻類病斑和早衰突變體的研究多涉及其防御反應(yīng)和抗病性增強(qiáng)的報(bào)道。本研究的野生型親本YY是一個具有廣譜稻瘟病抗性的地方品種，為了證實(shí)本研究的早衰突變體材料wl4的稻瘟病抗性是否發(fā)生改變，選用從福建省各稻瘟病重發(fā)區(qū)分離的24個強(qiáng)致病力的稻瘟病菌生理小種進(jìn)行室內(nèi)噴霧接菌，抗性鑒定結(jié)果：在用于鑒定的24個菌株中，野生型YY接菌后表現(xiàn)為抗病表型的菌株有16個，抗菌株率為66.67%;突變體w14接菌后表現(xiàn)為抗病表型的菌株有8個，抗菌株率為33.33%。突變體w14的抗菌株率明顯低于野生型，其中：突變體wI4對菌株SM17019-2、NH13093、NH17028、JY15015、NH15040、NH15040、NJ08022、NH17026-4的表型由抗病變?yōu)楦胁?，表明突變體wl4的稻瘟病抗性水平明顯降低（表1）。

田間和室內(nèi)接種水稻白葉枯病的抗性鑒定結(jié)果（圖2）表明：與野生型YY相比，突變體wl4均表現(xiàn)更為感病。室內(nèi)人工接種15d時(shí)，野生型YY的平均病斑長度為1.82cm（抗病水平），而突變體w14接種15d時(shí)的平均病斑長度為7.72cm（中感水平），突變體的病斑長度極顯著長于野生型YY（P《0.01）。大田分蘗盛期田間接種15d時(shí)，野生型YY的平均病斑長度為2.65cm（抗病水平），突變體w14接種15d時(shí)的平均病斑長度為15.96cm（感病水平），突變體病斑長度極顯著長于野生型YY（P《0.01）。

2.3突變體w14與植物衰老相關(guān)基因的表達(dá)

與野生型YY相比，突變體w14在苗期至分蘗盛期在農(nóng)藝性狀和表型上并無顯著差異，前人的研究結(jié)果表明，水稻發(fā)生衰老癥狀時(shí)會有一些保守基因或者標(biāo)志性基因的表達(dá)水平發(fā)生變化”，為了檢測本研究的突變體w14是否與前人的研究材料之間存在這些衰老關(guān)鍵基因的表達(dá)差異，筆者從文獻(xiàn)中選取了一些水稻早衰相關(guān)基因P40、NYC3、SGR、Osh36、Osh69和RCCR1作為檢測對象，以相同生育期的野生型品種YY為對照，用RT-PCR方法分別對突變體wI4和野生型YY進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果顯示：與野生型YY相比，突變體wl4中與葉綠體發(fā)育相關(guān)的基因PA0、NYC3均顯著上調(diào)表達(dá);促進(jìn)衰老的基因Osh36和RCCRl在突變體wl4中的表達(dá)量均顯著上調(diào)，其中Osh36的上調(diào)表達(dá)的差異性達(dá)到極顯著水平（P《0.01）。此外，在突變體w14中，控制葉綠素降解的相關(guān)基因SGR的表達(dá)量顯著上調(diào)，水稻衰老的標(biāo)志基因Osh69也出現(xiàn)了顯著的上調(diào)表達(dá)。本試驗(yàn)中所檢測的6個衰老相關(guān)基因均表現(xiàn)為在突變體w14中的表達(dá)量顯著高于野生型YY（圖3），表明突變體的表型是一個較為典型的衰老過程。

2.4突變體w14病程相關(guān)基因的表達(dá)

筆者前期分別對突變體w14和野生型YY進(jìn)行的稻瘟病和水稻白葉枯病抗性鑒定結(jié)果表明，突變體比野生型更為感病。因此，選取了水稻中11個病程相關(guān)基因進(jìn)行了表達(dá)分析，結(jié)果表明：與野生型YY相比，在相同的生育期，除了防衛(wèi)相關(guān)基因CEBip和PR5在突變體中的表達(dá)比野生型低之外，其他9個基因均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，其中：PRla和PR4在突變體中的表達(dá)上調(diào)13.5～25.4倍;Cthl在突變體中的表達(dá)，苗期上調(diào)了8.5倍，但成株期卻下調(diào)93.4%;PR1b、PBZ1、PR3均在成株期即出現(xiàn)衰老表型的時(shí)候出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)（圖4a、b）。以上結(jié)果說明，突變體中這些主要的病程相關(guān)基因的表達(dá)均發(fā)生了改變，這說明突變體可能因?yàn)楸旧砟承╆P(guān)鍵基因的突變造成了抵御病原菌的能力減弱，使防御體系變得更為敏感。突變體中許多病程相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)，這與前期抗病性鑒定結(jié)果一致。

3討論與結(jié)論

衰老是植物生長發(fā)育的自然過程，也是最后階段。在植物組織衰老的過程中，體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)會逐漸由衰老器官轉(zhuǎn)移到代謝旺盛的生殖器官等部位叼。因此，植物的正常衰老不管對生殖生長還是營養(yǎng)生長而言都十分重要18。眾所周知，早衰會造成作物產(chǎn)量降低，延緩衰老能夠保證作物的產(chǎn)量。有研究表明，水稻葉片推遲1d衰老，產(chǎn)量可增加2%左右！。因此，深人研究水稻衰老的機(jī)制，并探尋可行的延緩衰老的方法對于提高水稻產(chǎn)量具有積極的意義。

近年來，科學(xué)家們利用水稻突變體，通過對其進(jìn)行遺傳學(xué)和基因工程技術(shù)的研究，克隆獲得了大量的葉片衰老相關(guān)基因20。但在這些克隆的早衰相關(guān)基因中，多數(shù)是因基因突變造成的代謝過程中過氧化物累積從而造成水稻葉片細(xì)胞壞死而出現(xiàn)早衰，雖然有些突變體能夠因?yàn)轶w內(nèi)過氧化物的累積抵制某些病原微生物，從而表現(xiàn)出一定的抗病性，但與相同遺傳背景的野生型品種相比，這些突變體多數(shù)表現(xiàn)為形態(tài)變差，產(chǎn)量低，均不適合直接用于對栽培品種的改良，難以達(dá)到在提高作物抗病性的同時(shí)保障其產(chǎn)量和品質(zhì)的目的。本研究獲得的突變體wl4，與野生型YY相比較，其突變后表現(xiàn)為分蘗盛期出現(xiàn)早衰表型，通過進(jìn)一步對水稻衰老相關(guān)基因的表達(dá)分析表明，突變體wl4中這些衰老相關(guān)基因出現(xiàn)了顯著的上調(diào)表達(dá)，表明突變體wl4經(jīng)歷了典型的衰老過程。但是與前人研究的早衰突變體材料不同的是，w14在早衰表型出現(xiàn)后表現(xiàn)出過氧化物等一些代謝產(chǎn)物的積累，但在抗病性上卻表現(xiàn)出更為感病的表型;對11個水稻病程相關(guān)基因的表達(dá)分析結(jié)果也顯示，突變體wl4中病程相關(guān)基因PRla、PR4、Cthl、PRlb、PBZ1、PR3等均表現(xiàn)出顯著的上調(diào)表達(dá)，表明突變體中防御反應(yīng)體系與野生型YY相比發(fā)生了較為顯著的改變。在本研究中，如果控制突變體w14早衰的基因是因功能喪失造成了其感病的表型，則可以通過過量表達(dá)該基因，使其恢復(fù)或超過野生型抗性水平;如果控制突變體w14早衰表型的基因是因基因突變激活了下游基因造成了其感病的表型，則可以通過基因編輯的方法敲除相應(yīng)基因，使其獲得抗病的表型，從而實(shí)現(xiàn)在生產(chǎn)上的利用價(jià)值。如儲成才等”發(fā)現(xiàn)，植物衰老信號通路的重要成分OsNAP受ABA特異性誘導(dǎo)，通過直接調(diào)控葉綠素降解、營養(yǎng)再轉(zhuǎn)運(yùn)及其他衰老相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控葉片的衰老進(jìn)程。通過降低OsNAP基因表達(dá)可顯著延緩水稻葉片衰老，延長灌漿時(shí)間，從而提高水稻結(jié)實(shí)率和千粒重，最終使水稻產(chǎn)量得到顯著提高。但是，由于植物衰老機(jī)制復(fù)雜，同時(shí)受到植物體內(nèi)信號因子的精確調(diào)控，因此其生產(chǎn)利用為期尚早。且單一基因?qū)τ诮沂舅镜乃ダ蠙C(jī)制意義有限，只有通過對上、下游基因和互作基因進(jìn)行深人研究，同時(shí)構(gòu)建這些基因的遺傳網(wǎng)絡(luò)才能夠系統(tǒng)地解釋植物衰老的內(nèi)在機(jī)制，從而進(jìn)一步利用其遺傳規(guī)律對育種和生產(chǎn)提供幫助和指導(dǎo)。

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（責(zé)任編輯：楊小萍）

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