畢方鋮+戴宏芬+孟祥春

農(nóng)業(yè)部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室 廣東廣州 510640）

摘 要 構(gòu)建含潮霉素抗性基因和GFP基因的雙元載體pCAMBgfp，以其為轉(zhuǎn)化載體用農(nóng)桿菌EHA105介導的方法對芒果膠孢炭疽菌Cg-8菌株進行遺傳轉(zhuǎn)化，以潮霉素抗性和GFP熒光來篩選陽性轉(zhuǎn)化子。然后，通過離體接種芒果葉片和果實觀察病斑大小篩選致病性缺陷轉(zhuǎn)化子。結(jié)果獲得500個陽性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率為平均106個孢子可獲得400個左右同時具有潮霉素抗性和GFP熒光的陽性轉(zhuǎn)化子，且其經(jīng)多次在無潮霉素的培養(yǎng)基上傳代后能得到穩(wěn)定遺傳。隨機挑選其中13個突變體進行PCR檢測，均可擴增出潮霉素基因目的條帶，致病性分析從中篩選得到8個致病性減弱或缺失突變體。

關(guān)鍵詞 膠孢炭疽菌 ；遺傳轉(zhuǎn)化 ；突變體 ；致病性

分類號 S432.44

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation of Mango Colletotrichum gloeosporioides and Screening of the Mutants Defective in Pathogenicity

BI Fangcheng DAI Hongfen MENG Xiangchun

（Fruit Tree Research Institute / Ministry of Agriculture Key Laboratory of South Subtropical Fruit Biology and Genetic Resource Utilization， Guangdong Academy of Agricultural Science，

Guangzhou， Guangdong 510640）

Abstract The recombinant vector pCAMBgfp， containing hygromycin resistant gene and gfp reporter gene， was constructed and transformed into mango Colletotrichum gloeosporioides via Agrobacterium tumefaciens EHA105. Positive transformants were identified by both resistant to hygromycin and green fluorescence observation. Transformants defective in pathogenicity were screened out through inoculation assay on detached mango leave and fruit. Total 500 positive transformants were screened out from several transformation. The average transformation efficiency was up to 400 transformants per 106 conidia. All of the transformants tested remained stable in hygromycin resistant and gfp fluorescence after several generations of growth in the media absence of hygromycin. 13 candidate mutants were randomly selected for PCR detection of the gfp gene and 8 mutants shown pathogenicity reduction or lose.

Keywords Colletotrichum gloeosporioides ； transformation ； mutants ； pathogenicity

炭疽病菌（Colletotrichum spp.）是世界分子植物病理學研究中十大病原真菌之一，該病菌嚴重危害重要的經(jīng)濟作物，特別是水果，蔬菜及觀賞植物[1]。芒果炭疽病是全世界芒果種植區(qū)發(fā)生最普遍、為害最嚴重的病害之一，其主要由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum J.H.Simmonds）兩種病原菌引起[2]。目前，盡管多個炭疽菌的基因組測序已完成，且進行了一系列轉(zhuǎn)錄組分析[3-5]。但由于炭疽菌種類繁多及植物病原真菌和寄主互作的復雜性，目前對炭疽菌侵染特定植物而致病的各個環(huán)節(jié)發(fā)生機制，特別是對與致病性直接相關(guān)的功能基因知之甚少。因此，有必要利用各種特定的炭疽菌-植物互作系統(tǒng)開展研究。

1995年，根癌農(nóng)桿菌介異轉(zhuǎn)化釀酒酵母首次獲得成功[6]，此后，根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）的方法廣泛應用于絲狀真菌基因功能的研究，且在多種絲狀真菌中獲得成功[7-8]。目前，雖然國內(nèi)已有構(gòu)建橡膠炭疽菌和芒果炭疽菌ATMT突變體庫的報道[9-10]，但未獲得明顯的致病性缺陷轉(zhuǎn)化子。我們從芒果果實上分離了一株膠孢炭疽菌Cg-8，其能侵染芒果、番木瓜、鱷梨等多種熱帶亞熱帶水果，且其致病性和培養(yǎng)特征十分穩(wěn)定，適合作為ATMT方法的受體材料。本研究利用此方法獲得了幾百個陽性轉(zhuǎn)化子，從中篩選出了一些致病力有明顯缺陷的突變體，為分析插入位點的基因在炭疽菌-芒果致病過程中的功能提供了很好的突變材料，為進一步闡明炭疽菌的致病分子機制奠定基礎(chǔ)。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒

供試膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）菌株Cg-8為本實驗室保存的從芒果果實上分離得到的單胞培養(yǎng)物；根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105和質(zhì)粒pCAMBIA1300由中山大學生命科學學院姚楠教授惠贈，質(zhì)粒pCT-74由廣東省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所李春雨博士惠贈，為強組成型表達的sGFP的載體，其攜帶有真菌Pyrenophora tritici-repentis的ToxA啟動子，并帶有能在真菌中表達的潮霉素B（Hygromycin B）磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。

1.1.2 培養(yǎng)基

M3S（Modified Mathur's medium）培養(yǎng)基用于培養(yǎng)膠孢炭疽菌（g/L）[11]：2.5 g MgSO4·7H2O，2.7 g KH2PO4，1 g細菌蛋白胨，1 g酵母提取物，10 g蔗糖，250 mg氯霉素，121℃，1×105 Pa條件下滅菌20 min。

MM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105（g/L）：K2HPO4 2.05 g，KH2PO4 1.45 g，NaCl 0.15 g，MgSO4·7 H2O 0.5 g，CaC12 0.051 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002 5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，Glucose 2.0 g（滅菌后加入），121℃，1×105 Pa條件下滅菌20 min。

IM培養(yǎng)基用于活化農(nóng)桿菌EHA105 Vir基因（g/L）：MES·2H2O 8.54 g pH 5.3，甘油 5 g，乙酰丁香酮（AS）200 μM（滅菌后加入），K2HPO4 2.05 g，KH2PO4 1.45 g，NaCl 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaC12 0.051 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002 5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，glucose 1.0 g（滅菌后加入），121℃，1×105 Pa條件下滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基：IM固體培養(yǎng)基中加入100 μg/mL潮霉素B，400 μM 頭孢霉素，或者M3S培養(yǎng)基加上述抗生素。

1.2 方法

1.2.1 雙元載體pCAMBgfp的構(gòu)建及鑒定

轉(zhuǎn)化載體pCAMBgfp的構(gòu)建方法：將經(jīng)Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切產(chǎn)生的含sGFP和潮霉素B抗性基因的片段與經(jīng)同樣雙酶切的pCAMBIA1300載體連接而成（圖1）。載體經(jīng)酶切驗證正確后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中備用（圖1）。

1.2.2 農(nóng)桿菌菌液的制備

將含有重組質(zhì)粒pCAMBgfp的農(nóng)桿菌EHA105在含50 μg/mL Rif和100 μg /mL Kan 的LB平板上劃線培養(yǎng)，挑單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL Rif和100 μg/mL Kan）中，28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)的上述農(nóng)桿菌菌液按1∶100比例加入至10 mL MM培養(yǎng)基中，在28℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h，將上述培養(yǎng)物，室溫，2 400 g離心5 min，棄去上清，用適量IM培養(yǎng)基（含乙酰丁香酮）重懸至OD600=0.2左右，然后在28℃，200 r/min條件下誘導培養(yǎng)6～8 h后用于轉(zhuǎn)化。

1.2.3 膠孢炭疽菌的轉(zhuǎn)化

炭疽菌孢子的準備：在已產(chǎn)孢的M3S平板中加入無菌水，輕輕震蕩，然后用三層滅菌擦鏡紙過濾收集分生孢子，2400 g離心5 min，用IM培養(yǎng)基重懸孢子并調(diào)至最終濃度為1×106 個/mL。

轉(zhuǎn)化：首先，將孔徑為0.45 μm的無菌Hybond N+尼龍膜平鋪于IM+200 μmol/L 乙酰丁香酮平板上。然后，取1.0 mL誘導培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液與1.0 mL濃度為1×106個/mL分生孢子混合，取100 μL混合液均勻涂布于鋪有尼龍膜的IM固體培養(yǎng)基上，在25℃避光的條件下共培養(yǎng)48 h。然后將尼龍膜轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上（含200 μg/mL潮霉素B和400 μmol/L頭孢霉素），在25℃下培養(yǎng)2～3 d后揭去尼龍膜，繼續(xù)培養(yǎng)直至菌落出現(xiàn)。將具有潮霉素抗性的單菌落轉(zhuǎn)接于篩選培養(yǎng)基（含有200 μg/mL潮霉素），并于27℃培養(yǎng)仍具抗性的則為候選的轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子的鑒定

取少量轉(zhuǎn)化子的孢子接種于液體M3S培養(yǎng)基中，在27℃，200 r/min條件下培養(yǎng)2 d，用濾紙收集菌絲，用廣州東盛生物科技有限公司的基因組DNA提取試劑盒提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。設(shè)計引物HYG-F：5′-AAGTTCGACAGCGTCTCCGAC-3′，HYG-R：5′-TCTACACAGCCATCGGTCCAG-3′用于擴增潮霉素B抗性基因。同時，隨機挑取轉(zhuǎn)化子的菌絲和孢子制片，在ZEISS/德國Axio Observer A1熒光顯微鏡下觀察是否有GFP熒光來進一步鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.5 致病性缺陷轉(zhuǎn)化子的篩選

取幼嫩芒果葉片，用注射器針頭在葉片側(cè)脈上打孔，每片葉上打6個，將轉(zhuǎn)化子帶菌瓊脂塊（直徑6 mm）接種到葉片上，菌絲體與葉片表面直接接觸，以野生型為對照，初步篩選致病力缺陷的轉(zhuǎn)化子，初篩得到致病力缺陷轉(zhuǎn)化子進一步用孢子液接種芒果果實的方法進行復篩，方法是用無菌水將孢子從平板上沖洗下來，調(diào)節(jié)濃度至1×106個孢子/mL備用。青熟的象牙芒購于本地市場，用細針在果實上打3排約3 mm深的小孔，每排5個，每孔接種菌液8 μL。同一果實上設(shè)一排野生型對照，2排是候選轉(zhuǎn)化子菌液，每個轉(zhuǎn)化子重復接種10個果。將接種好的芒果放置于保濕盤內(nèi)，27℃培養(yǎng)，接種后第3天開始逐日觀察，并測定病斑的直徑。endprint

1.2.6 轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性的鑒定

選取部分炭疽菌轉(zhuǎn)化子，活化后接種到不含潮霉素B的M3S平板上，在溫度27℃條件下培養(yǎng)。連續(xù)傳代5次后，打取各轉(zhuǎn)化子菌落邊緣菌絲塊，分別接種到含有200 μg/mL潮霉素B的M3S平板上，27℃條件下培養(yǎng)，觀察轉(zhuǎn)化子的生長情況，并在熒光顯微鏡下檢測GFP熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 潮霉素篩選濃度的確定及插入轉(zhuǎn)化子的獲得

為了確定C. gloeosporioides的篩選濃度，取5 μL（106/mL）的孢子液滴在含不同潮霉素濃度培養(yǎng)基的中央，7 d后觀察發(fā)現(xiàn)，Cg-8在含潮霉素濃度為50 μg/mL的M3S平板上生長微弱，在100 μg/mL潮霉素的M3S平板上生長極其微弱，當潮霉素濃度在150 μg/mL或以上時能夠完全抑制Cg-8的生長，因此確定150 μg/mL為篩選轉(zhuǎn)化子的濃度（圖2A）。圖2B為在篩選培養(yǎng)基上抗性轉(zhuǎn)化子的生長情況。

2.2 轉(zhuǎn)化子驗證

經(jīng)過數(shù)次轉(zhuǎn)化實驗，共得到500個具有潮霉素抗性的Cg-8轉(zhuǎn)化子，如圖3所示。隨機挑選了13個轉(zhuǎn)化子，利用PCR擴增潮霉素B抗性基因，13個轉(zhuǎn)化子和陽性質(zhì)粒pCAMBgfp與pCT-74均能擴增出大小約900 bp的目標片段，而野生型菌Cg-8和陰性對照未擴增出目標片段（圖3A）。進一步用熒光顯微鏡觀察到各轉(zhuǎn)化子的菌絲和孢子均有綠色GFP熒光（圖3B和3C），說明外源GFP基因能在芒果膠孢炭疽菌中表達。另外，經(jīng)過多次在無潮霉素的培養(yǎng)基上傳代后，仍可同樣擴增出潮霉素B抗性基因，并觀察到綠色熒光（結(jié)果略），說明轉(zhuǎn)化子的潮霉素抗性及GFP熒光能穩(wěn)定遺傳。

2.3 致病性缺陷突變體的篩選

用C. gloeosporioides孢子懸浮液接種離體芒果果實和葉片，對上述經(jīng)PCR驗證為陽性的13個轉(zhuǎn)化子進行致病性分析，結(jié)果證明其中有11個轉(zhuǎn)化子的致病性減弱或缺失，另2個轉(zhuǎn)化子的致病性增強。圖4表示野生型和部分轉(zhuǎn)化子孢子液接種芒果葉片和果實后的致病情況。同野生型對照Cg-8相比，轉(zhuǎn)化子M14在芒果葉片上的致病性缺失（圖4A左一），而M5和M30的致病性略增強。在接種芒果果實時，同野生型對照Cg-8（WT）相比，轉(zhuǎn)化子M2和M3致病性嚴重減弱，M28的致病性略降低，而M22的致病性沒有顯著改變。

3 討論與結(jié)論

與原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系相比，ATMT方法不需要制備原生質(zhì)體，簡化了操作過程，且有轉(zhuǎn)化效率高，單拷貝插入突變體多等優(yōu)點[7]。ATMT方法的轉(zhuǎn)化效率受農(nóng)桿菌菌種，孢子濃度，共培養(yǎng)溫度及共培養(yǎng)時間等多種因素的影響[7-8，12-13]，通過優(yōu)化這些條件可以提高轉(zhuǎn)化效率。國內(nèi)已有構(gòu)建橡膠炭疽菌和芒果炭疽菌ATMT突變體庫的少數(shù)報道，其轉(zhuǎn)化效率在130～1000轉(zhuǎn)化子/106個孢子之間，但致病性驗證試驗結(jié)果表明，未獲得明顯的致病性缺陷轉(zhuǎn)化子[9-10]。本研究參考已有的報道，首先構(gòu)建了含潮霉素抗性基因和GFP基因的雙元載體，然后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，以其作為轉(zhuǎn)化菌對芒果膠孢炭疽菌Cg-8菌株進行遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果顯示，將農(nóng)桿菌和106/mL孢子等體積混合，在25℃下共培養(yǎng)3天左右，獲得400個轉(zhuǎn)化子/106孢子，這與已報道炭疽菌的轉(zhuǎn)化效率相當。本研究所用的載體pCAMBgfp既具有抗生素選擇基因，同時還有由Pyrenophora tritici-repentis的ToxA啟動子驅(qū)動的gfp基因[14]，所以陽性轉(zhuǎn)化子可以通過潮霉素抗性來鑒定，也可以用熒光顯微鏡來檢測，這樣就可以跟蹤GFP熒光來觀察突變體在自然環(huán)境條件下的萌發(fā)、生長、分布以及侵染果實的過程，有利于更好的研究膠胞炭疽菌致病性相關(guān)基因的功能及其與植物之間的相互作用。

利用本研究的ATMT方法，本試驗結(jié)果篩選得到一些具有明顯致病性缺陷的芒果C. gloeosporioides突變體，包括致病力減弱、或喪失、或增強的突變體，這為國內(nèi)首次報道，為分析插入位點的基因在炭疽菌-芒果致病過程中的功能提供了很好的突變材料，同時驗證了此轉(zhuǎn)化和篩選方法的有效性。我們正在進一步利用Tail-PCR確定這些突變體的T-DNA插入位點及其相應基因，并對相應基因的功能開展深入研究，以尋找到更多的炭疽病菌致病性相關(guān)功能基因，明確其在炭疽菌-芒果致病過程中的分子作用機制。

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