李 豪，朱海麗，李 岱

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院五官醫(yī)學(xué)院)

近年來(lái)的研究表明糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展不僅與血糖含量升高有關(guān)，也與體內(nèi)血糖水平的波動(dòng)有密切聯(lián)系[1]。血糖波動(dòng)指血糖水平在其高峰和低谷之間變化的不穩(wěn)定狀態(tài)，不僅包括短期血糖波動(dòng)，即日間血糖波動(dòng)和日內(nèi)血糖波動(dòng)，還包括長(zhǎng)期血糖波動(dòng)[2]。糖尿病患者血糖值的不穩(wěn)定狀態(tài)對(duì)各組織造成的損傷已逐漸引起了人們的重視，但對(duì)眼部損傷的相關(guān)研究甚少，因此，對(duì)血糖波動(dòng)條件下眼部細(xì)胞的研究有助于我們對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)的治療。

DR的最主要病理變化是眼部微血管病理性改變，其中RPE細(xì)胞作為視網(wǎng)膜最外層的主要細(xì)胞，在維持正常視覺(jué)方面起了重要作用。它向外與脈胳膜相連參與血—視網(wǎng)膜屏障的形成，向內(nèi)參與視網(wǎng)膜光感受器的視覺(jué)形成，如果RPE細(xì)胞發(fā)生損傷則人的正常視力會(huì)受到嚴(yán)重?fù)p害。糖尿病患者血糖水平較常人高，高糖環(huán)境會(huì)對(duì)RPE細(xì)胞造成損傷，但許多患者血糖水平并非一直維持恒定，而是隨時(shí)間發(fā)生波動(dòng)變化，目前對(duì)于血糖波動(dòng)環(huán)境下視力損害已有所認(rèn)識(shí)，但還沒(méi)有有效方法抑制這一損害。鑒于RPE細(xì)胞在視網(wǎng)膜中的重要性及對(duì)血糖濃度的敏感性[3]，因此，我們選用RPE細(xì)胞作為我們的模型細(xì)胞。

姜黃素(curcumin，Cur)是一種從姜科、天南星科等植物中提取的一多酚類化合物，具有降血糖、降脂、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗抑郁等多種藥理效應(yīng)，其廣泛運(yùn)用于治療各種糖尿病、心血管、呼吸、神經(jīng)、自身免疫等多系統(tǒng)的疾病。姜黃素可改善糖尿病引起的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，減少細(xì)胞凋亡[4]，從而改善DR的臨床表現(xiàn)。本研究通過(guò)建立波動(dòng)高糖條件下的ARPE-19細(xì)胞模型，探討姜黃素對(duì)細(xì)胞模型的保護(hù)作用，為DR的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞株：人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19) (中山眼科中心所提供)，姜黃素 (純度≥98%，Sigma 公司)，胎牛血清 (Gibco)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，CCK-8試劑盒(Sigma-Aldrich)，活性氧 ROS 測(cè)試盒(Sigma-Aldrich)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與造模

我們依據(jù)前人的成功造模經(jīng)驗(yàn)[5]，將正常培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞分成正常血糖組(normal glucose，NG)、波動(dòng)高滲組 (osmotic control，OC)、高糖組(high glucose，HG)、波動(dòng)高糖組 (intermittent high glucose，IHG)、血糖波動(dòng)+低濃度給藥組(IGH+10μg/mL Cur)、血糖波動(dòng)+中濃度給藥組(IGH+20μg/mL Cur)、血糖波動(dòng)+高濃度給藥組(IGH+40μg/mL Cur)共7組。正常組用5.5mmol/L DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，高糖組用33 mmol/L DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，波動(dòng)高滲組用含有5.5mmol/L甘露醇的DMEM培養(yǎng)基和含有25mmol/L甘露醇的DMEM培養(yǎng)基中波動(dòng)培養(yǎng)，每12h波動(dòng)一次，模擬波動(dòng)高糖組相似的波動(dòng)性高滲環(huán)境。波動(dòng)高糖組日間高糖3h低糖2h，波動(dòng)3次，高糖過(guò)夜，24h為一周期。血糖波動(dòng)+低濃度給藥組、血糖波動(dòng)+中濃度給藥組、血糖波動(dòng)+高濃度給藥組分別用含有10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL姜黃素的正常培養(yǎng)基和高糖培養(yǎng)基按血糖波動(dòng)組方法培養(yǎng)。每組細(xì)胞培養(yǎng)3d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將分組培養(yǎng)3d后的ARPE-19細(xì)胞置于倒置顯微鏡下，觀察各組細(xì)胞的形態(tài)差異。

1.2.3 細(xì)胞活力檢測(cè)(CCK-8法)

將正常培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞制成細(xì)胞濃度為5～10×104/mL的細(xì)胞懸液，將均勻的細(xì)胞懸液加入到96孔板中，其中每孔加入200μL，置于培養(yǎng)箱24h待細(xì)胞貼壁。將已貼壁的96孔細(xì)胞吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后，加入無(wú)血清培養(yǎng)基2h，同步化后按照相應(yīng)的分組進(jìn)行干預(yù)。藥物干預(yù)3d后，每孔內(nèi)加入10μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。待各組顏色分明，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm 處各孔的OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.4 細(xì)胞ROS水平的檢測(cè)(免疫熒光法)

(1)熒光圖像采集。選取生長(zhǎng)融合程度接近 80%～90%的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)胰酶消化、重懸后，計(jì)數(shù)并用含10%血清的DMEM制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，每孔1mL提前一天接種于6 孔板上。待細(xì)胞融化度達(dá)到 70%左右，用不含血清的培養(yǎng)基進(jìn)行同步化處理 2h。隨后將細(xì)胞進(jìn)行分組培養(yǎng)。細(xì)胞分組培養(yǎng)及藥物干預(yù)3d后，將DCFH-DA探針直接加入到每組的培養(yǎng)基中，使探針的終濃度達(dá)到10μM。操作過(guò)程中，注意避光，盡量在暗環(huán)境進(jìn)行操作，也可以在加入探針后，將孔板用錫箔紙進(jìn)行包裹，然后在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30min。暗環(huán)境下用預(yù)溫PBS清洗 3 次，清洗結(jié)束后，熒光顯微鏡下觀察及拍照。

(2)熒光強(qiáng)度檢測(cè)。將混勻后的細(xì)胞懸液接種到96孔板內(nèi)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，按分組培養(yǎng)細(xì)胞，3d后完成細(xì)胞造模，每孔加入DCFH-DA 探針繼續(xù)培養(yǎng)30min，PBS清洗3次，將96孔板置入多功能酶標(biāo)儀中，激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組形態(tài)學(xué)差異

圖1(封二)中可以看到正常組細(xì)胞NG形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)清晰，細(xì)胞接連緊密，成片生長(zhǎng)。波動(dòng)高滲組OC中部分細(xì)胞呈卵圓形，但大部分細(xì)胞形態(tài)完整，與正常組相同。高糖組HG及波動(dòng)組IHG中只有少數(shù)細(xì)胞呈正常的長(zhǎng)梭形，且波動(dòng)組中大部分細(xì)胞形態(tài)不完整。隨著姜黃素含量的增加，細(xì)胞逐漸趨于正常，當(dāng)達(dá)到40μg/mL時(shí)細(xì)胞大部分呈梭形，形態(tài)完整，提示此組細(xì)胞在波動(dòng)高糖條件下的損傷最小。

2.2 各組細(xì)胞活性

通過(guò)CCK-8檢測(cè)不同條件下的細(xì)胞活性，我們發(fā)現(xiàn)不同條件處理后的ARPE-19細(xì)胞活性有了顯著的差異(P<0.05)。HG細(xì)胞活性較NG組有所降低(P<0.05)，IGH組的細(xì)胞活性較GH組降低更為明顯(P<0.05)。OC組與NG組相差不大(P>0.05)，與IHG組有顯著差異(P<0.05)，IHG+姜黃素組的細(xì)胞活力增強(qiáng)(P<0.05)，其中IHG+40μg/mL姜黃素組的細(xì)胞活力最強(qiáng)，見(jiàn)表1。

表1 各組ARPE-19細(xì)胞活性對(duì)比

2.3 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)(化學(xué)熒光法)

正常組NG和波動(dòng)高滲組OC熒光水平明顯最弱，高糖組HG較正常組高，波動(dòng)高糖組IHG在本次試驗(yàn)中熒光水平最高的。而在波動(dòng)高糖+姜黃素組熒光水平已經(jīng)十分接近正常組，與高滲組相當(dāng)，而其它兩組的熒光強(qiáng)度仍然較強(qiáng)。見(jiàn)圖2(封二)。

將各分組ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)3d后，使用酶標(biāo)儀對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平進(jìn)行定量分析，其結(jié)果與熒光圖片基本一致。見(jiàn)表2。

表2 ARPE-19細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度

3 討 論

由于一直認(rèn)為高糖是DR的主要因素[6]，所以以往的研究更重視高糖環(huán)境對(duì)視網(wǎng)膜的損害，對(duì)于血糖波動(dòng)環(huán)境下RPE的損傷機(jī)制的研究較少，但是DM患者由于胰島素抵抗、飲食控制不良、運(yùn)動(dòng)缺乏導(dǎo)致機(jī)體血糖值較正常人波動(dòng)幅度明顯增大[7]，大幅的血糖波動(dòng)使組織細(xì)胞對(duì)高糖的適應(yīng)性降低，從而使機(jī)體受到更嚴(yán)重的損害[8]。有研究表明姜黃素能夠抑制高糖環(huán)境下DR的損傷[9-11]，但對(duì)于血糖不穩(wěn)定DR患者的視力保護(hù)機(jī)制尚不清楚。鑒于姜黃素的藥理作用，本課題對(duì)姜黃素抑制血糖波動(dòng)環(huán)境下RPE的損害機(jī)制進(jìn)行了研究和記錄。本研究發(fā)現(xiàn)血糖波動(dòng)環(huán)境下RPE細(xì)胞的氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及形態(tài)改變較正常組加強(qiáng)，并且強(qiáng)于持續(xù)高糖組，這表明波動(dòng)高糖較持續(xù)高糖對(duì)細(xì)胞的傷害更加嚴(yán)重，氧化應(yīng)激可能在細(xì)胞的損傷中起重要作用。同時(shí)我們用不同濃度姜黃素對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)血糖波動(dòng)環(huán)境下RPE細(xì)胞的氧化應(yīng)激、形態(tài)改變均有不同程度的改善，這說(shuō)明姜黃素的確能夠?qū)ρ遣▌?dòng)環(huán)境下對(duì)RPE細(xì)胞起保護(hù)作用。

人RPE細(xì)胞處于脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層之間，是吸收眼底光線的主要部位，其解剖位置使其長(zhǎng)期處于高氧化環(huán)境，因而極易受到氧化損傷，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)無(wú)法清除過(guò)量的ROS時(shí)，過(guò)剩的 ROS 就會(huì)造成細(xì)胞毒性作用， 這一過(guò)程就稱為氧化應(yīng)激。研究表明高糖環(huán)境下的RPE細(xì)胞會(huì)因?yàn)檠趸瘧?yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞功能損害與凋亡[12]，但波動(dòng)高糖環(huán)境是否會(huì)加劇RPE細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)還尚不清楚。本研究中我們發(fā)現(xiàn)波動(dòng)高糖組中的ROS表達(dá)量顯著高于其它組，并且CCK-8結(jié)果表明波動(dòng)高糖組的RPE細(xì)胞活力最低，值得注意的是波動(dòng)組的ROS表達(dá)量明顯高于持續(xù)高糖組，提示氧化應(yīng)激可能是波動(dòng)高糖環(huán)境下RPE細(xì)胞損傷的重要途徑。過(guò)量的ROS可以使RPE細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達(dá)上調(diào)[13]，活化的NF-κB可使TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子增加[14]，同時(shí)TNF-α、IL-1β等也可使NF-κB被激活[13]，從而形成正反饋，加速RPE細(xì)胞的損傷。由于DR本質(zhì)是炎癥疾病，炎性介質(zhì)在DR的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，因此，我們推測(cè)波動(dòng)高糖環(huán)境下ROS的增加同樣也會(huì)使RPE細(xì)胞炎性因子的表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，所以抑制波動(dòng)高糖中RPE細(xì)胞氧化損傷的藥物，對(duì)DR的臨床治療具有重要意義。

姜黃素具有降血糖、抗氧化、抗炎等多種藥理效應(yīng)，可改善糖尿病引起的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，降低氧化反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡[15]，從而改善DR的臨床表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)血糖波動(dòng)細(xì)胞模型，分別與正常血糖組與高糖組進(jìn)行對(duì)比，同時(shí)設(shè)立波動(dòng)高滲組排除波動(dòng)組中滲透壓對(duì)細(xì)胞的影響，結(jié)果表明，血糖波動(dòng)對(duì)細(xì)胞的損傷最大，而隨著姜黃素濃度的增加，波動(dòng)高糖組中的RPE細(xì)胞形態(tài)活力逐漸趨于正常，ROS水平下降，說(shuō)明姜黃素對(duì)血糖波動(dòng)環(huán)境下的RPE細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用。由于RPE細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)促進(jìn)炎性因子過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此，在今后的工作中進(jìn)一步探討血糖波動(dòng)對(duì)RPE細(xì)胞的凋亡機(jī)制以及姜黃素對(duì)細(xì)胞的保護(hù)任務(wù)用，為姜黃素治療DR的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。