吳 喆，韓 璐

(湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

胰腺對人體來說至關(guān)重要，其具有內(nèi)分泌和外分泌的作用。據(jù)《2012中國腫瘤登記年報(bào)》統(tǒng)計(jì)，在我國經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，胰腺癌新發(fā)估計(jì)病例數(shù)列男性第6位，女性第7位，并且呈快速上升趨勢[1]。作為一種消化道惡性腫瘤，胰腺癌5年生存率低于10%，80%的胰腺癌患者確診時(shí)已經(jīng)是中晚期[2]。如何早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者，擴(kuò)大未轉(zhuǎn)移患者的比例，是提高胰腺癌治療效果的關(guān)鍵[3]。KRAS是一個(gè)原癌基因，臨床數(shù)據(jù)表明[4-5]，KRAS突變的患者生存期要遠(yuǎn)低于未發(fā)生KRAS突變的患者，接近90%的胰腺癌患者會發(fā)生KRAS突變，然而KRAS在胰腺癌中表達(dá)及預(yù)后的報(bào)道，目前尚不多見。本研究擬應(yīng)用癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)，分析KRAS在胰腺癌發(fā)生和發(fā)展中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 資料來源

納入統(tǒng)計(jì)的資料均來自TCGA PanCancer Atlas數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/，截止時(shí)間為2020年6月)，TCGA胰腺癌原始數(shù)據(jù)來自NCI(National cancer institute)，突變數(shù)據(jù)來源GDAC Firehose。

1.2 基因KRAS在胰腺癌中的表達(dá)分析

通過cBioPortal平臺(http://www.cbioportal.org)，獲得TCGA數(shù)據(jù)庫中的184例胰腺癌樣本，其中175例臨床樣本均具有完整的基因序列(含miRNAseq 、mRNAseq 數(shù)據(jù))和拷貝數(shù)變異(CNAs)，應(yīng)用Oncoprint、Mutations及Plot選項(xiàng)分析KRAS基因的表達(dá)情況。

1.3 基因KRAS的主要相關(guān)蛋白及其功能分析

應(yīng)用GeneCards平臺(http://www.genecards.org/)查找KRAS基因相關(guān)蛋白，構(gòu)建KRAS相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)樹圖。通過STRING(https://string-db.org/)查找并歸納相關(guān)蛋白的功能，進(jìn)行蛋白生物作用途徑的富集分析。

1.4 基因KRAS在胰腺癌中的生存分析

通過cBioPortal 平臺應(yīng)用survival 選項(xiàng)分析175例樣本中基因KRAS表達(dá)與生存時(shí)間的Kaplan-Meier 關(guān)系圖，以及l(fā)og-rank檢驗(yàn)KRAS基因變異與胰腺癌預(yù)后無復(fù)發(fā)生存期(relapse-free survival，RFS)的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

生存分析采用Kaplan-Meier (K-M)曲線，Log-rank檢驗(yàn)比較差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 KRAS基因在胰腺癌中的表達(dá)情況

TCGA數(shù)據(jù)庫中，175例胰腺癌樣本中有117例發(fā)生KRAS基因變異，變異率為67%，包括擴(kuò)增(Amplification)8例(1.08%)見圖1。外顯子測序結(jié)果顯示，KRAS基因主要作用于Ras基因家族，多數(shù)KRAS基因突變(131個(gè))發(fā)生于Ras的12號密碼子(G12 D/V/R)，見圖2。多序列比對結(jié)果顯示見圖3。

圖1 KRAS基因在胰腺癌中的變異情況(截取的部分熱圖)

圖2 KRAS基因的外顯子測序結(jié)果

圖3 Ras中突變的多序列比對結(jié)果

2.2 KRAS基因的主要關(guān)聯(lián)基因分析

應(yīng)用Co-expression選項(xiàng)，得到KRAS基因的1個(gè)主要正相關(guān)(positively correlated)基因，為TMOD3，Spearman相關(guān)系數(shù)值為0.7，如圖4(封三)所示，即說明KRAS基因突變發(fā)生時(shí)往往伴有其他基因的改變。此外，應(yīng)用Enrichments選項(xiàng)選擇Mutations，得到KRAS基因1個(gè)有顯著性的共突變基因，為TP53基因，見圖5A(封三)；圖5B(封三)則顯示，KRAS基因突變組與KRAS基因未突變組中TP53基因及其他基因的突變頻率，其中TP53基因在KRAS基因突變組的突變頻率為76.92%(90/117)，p-Value為1.49 e-9。

2.3 KRAS基因主要相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析

應(yīng)用GeneCards分析KRAS基因主要相關(guān)蛋白，主要蛋白包括ARAF、BRAF、RAF1、NRAS、HRAS、PIK3CA、PIK3CG、SOS1、EGFR、ERBB2。把上述基因全部輸入STRING平臺(https://string-db.org/)，構(gòu)建得到基因KRAS相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6(封三)。節(jié)點(diǎn)數(shù)：11，邊數(shù)：49，平均節(jié)點(diǎn)數(shù)：8.91，局部聚類系數(shù)(local clustering coefficient)：0.918，PPI富集P值：3.95e-09，通過STRING，將以上蛋白進(jìn)行通路富集分析，其涉及的生理過程主要包括蛋白質(zhì)磷酸化、MAPK級聯(lián)反應(yīng)、MAP激酶活性的正調(diào)控及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，見表1。

表1 KRAS基因相關(guān)蛋白參與的主要富集生理過程[Biological Process(GO)]

2.4 KRAS基因變異與胰腺癌的生存率比較

KRAS基因與胰腺癌患者生存率的比較，如圖7(封三)所示。KRAS變異組總生存時(shí)間(中位數(shù)為19.48月)顯著低于無變異組(中位數(shù)為29.99月)(P=0.0347)，見圖7A；KRAS的變異與患者無病生存時(shí)間有關(guān)(P=0.050)，見圖7B。

3 討 論

胰腺由于位置深、早期癥狀不明顯以及缺乏有效的胰腺癌篩檢與治療手段，使得晚期胰腺癌的手術(shù)死亡率較高，而治愈率偏低[6]。目前研究表明[7]，Ras基因是人類癌癥中突變最頻繁的癌基因家族，與人類腫瘤相關(guān)的基因有三種：NRAS、HRAS和KRAS，分別定位在1、11和12號染色體上。在Ras基因家族中，KRAS對人類的癌癥影響最大，KRAS基因突變比例超過80%，往往發(fā)生在腫瘤惡變的早期，并且原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的KRAS基因高度保持一致[8]。其他研究證實(shí)[9-10]，KRAS基因就像體內(nèi)一個(gè)“分子開關(guān)”，它在腫瘤細(xì)胞生長以及血管生成等過程的信號傳導(dǎo)通路中起著重要調(diào)控作用，正常的KRAS基因可抑制腫瘤細(xì)胞生長，而一旦發(fā)生突變，則導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

資料表明[11]，絕大多數(shù)的胰腺腫瘤都存在KRAS基因突變，然而KRAS并不能作為胰腺癌的特異性生物標(biāo)志物，說明其對胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展以及預(yù)后的影響是十分復(fù)雜的。本研究應(yīng)用TCGA、cBioportal及GeneCards 在線數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，KRAS基因突變主要為錯(cuò)義突變，且絕大多數(shù)突變位點(diǎn)在12號密碼子，這與朱曉麗等[12]報(bào)道我國結(jié)直腸癌患者中KRAS突變類型多為GGT > GAT(G12D)、GGT > GTT(G12V)相一致。本研究基于生物信息學(xué)分析了KRAS基因的主要關(guān)聯(lián)基因，比較了KRAS基因與TMOD3基因的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TMOD3與KRAS基因在胰腺癌中存在共表達(dá)關(guān)系。TMOD3是一個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，與該基因相關(guān)的基因本體(GO)注釋包括影響肌動蛋白結(jié)合和原肌球蛋白結(jié)合、調(diào)控極化上皮細(xì)胞形態(tài)，在多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[13]，TMOD3可通過MAPK/ERK信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長、侵襲和遷移，可能成為肝癌的候選生物標(biāo)志物。本研究還發(fā)現(xiàn)，KRAS基因發(fā)生突變的胰腺癌患者也有較大可能出現(xiàn)TP53基因突變，TP53也是與人類惡性腫瘤相關(guān)性最高的一種抑癌基因，結(jié)果提示TP53和KRAS基因可能存在協(xié)同作用，即說明及早對患者進(jìn)行TP53和KRAS基因檢測，可能實(shí)現(xiàn)對部分胰腺癌患者的早期預(yù)警。本研究通過生物學(xué)通路和蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析等生物信息學(xué)方法，鑒定了KRAS基因的主要關(guān)聯(lián)蛋白，這些蛋白包括NRAS、HRAS、ARAF、BRAF、RAF1、PIK3CA、ERBB2、EGFR、SOS1、PIK3CG。通過富集分析，其涉及的生理過程主要包括蛋白質(zhì)磷酸化、MAPK級聯(lián)反應(yīng)及MAP激酶活性的正調(diào)控等，與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路RAS-MAPK密切相關(guān)，該通路有可能成為將來胰腺癌治療的一個(gè)潛在靶向通路。

胰腺癌是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，約90%為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌[14]。臨床數(shù)據(jù)表明[15-16]，未接受治療的胰腺癌患者的生存期約為4個(gè)月，接受旁路手術(shù)治療的患者生存期約7個(gè)月，切除手術(shù)后患者一般能生存16個(gè)月。早期診斷和早期治療是提高和改善胰腺癌預(yù)后的關(guān)鍵，手術(shù)后應(yīng)用放化療等輔助治療可提高生存率。對手術(shù)輔助化療并加用放療的患者，其2年生存率可達(dá)40%。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生KRAS突變的胰腺癌患者的死亡人數(shù)遠(yuǎn)高于未發(fā)生KRAS突變的胰腺癌患者人數(shù)，且變異率低的患者生存時(shí)間較長，提示KRAS基因突變與胰腺癌預(yù)后差有顯著的相關(guān)性，KRAS基因可能成為胰腺癌患者預(yù)后良好的一個(gè)指標(biāo)。

綜上所述，本研究初步確認(rèn)KRAS的表達(dá)可能不能作為胰腺癌患者的獨(dú)立預(yù)測因子，但KRAS和TP53基因的異常表達(dá)與胰腺癌患者的生存及不良預(yù)后密切相關(guān)，分析了KRAS基因所調(diào)控的RAS-MAPK通路及相關(guān)蛋白，為KRAS基因在臨床上針對胰腺癌的早期篩檢提供了一定的參考價(jià)值。