王 睿，董 超，金小紅，高 濤**

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學院非動力核技術(shù)與化學生物學院)

線粒體是真核細胞中重要的細胞器，在細胞的能量代謝，鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控及細胞凋亡控制中發(fā)揮重要的作用[1-2]。許多疾病如癌癥、阿爾茨海默癥、糖尿病、衰老等都和線粒體的狀態(tài)相關(guān)[3]。因此，線粒體也是細胞的“狀態(tài)風向標”。以腫瘤細胞為例，腫瘤細胞的無序增殖，需要更多的能量參入細胞的代謝。因此，正常細胞和癌細胞的線粒體存在較大的差異[4]。研究發(fā)現(xiàn)，癌細胞線粒體的跨膜電勢遠高于正常細胞線粒體，以此為靶點的藥物能富集于癌細胞線粒體，藥物在癌細胞中濃度比正常細胞高近千倍[5]。在使用此類藥物進行治療時，可以極大地提高藥物對腫瘤細胞的活性而降低對正常細胞的影響，是解決抗腫瘤藥物的副作用及耐藥性的重要手段[6-8]。此外，將抗氧化的小分子化合物靶向進入線粒體，也是合成治療神經(jīng)退行性新疾病及抗衰老藥物的重要策略[9]。

藥物的線粒體靶向功能的實現(xiàn)，和線粒體靶向載體的選擇密切相關(guān)。目前常用的線粒體靶向載體有 Rhodamine-123、F16、三苯基膦鹽等電子移位親脂性陽離子(DLCs)[10-12]。但是這些化合物存在熒光強度弱，合成難度大，細胞毒性大的弱點，有待進一步的改進。作為前期工作，本課題組在線粒體靶向載體的篩選方面做了大量的預研工作。我們使用吡啶-4-甲醛合成了具有熒光特性的化合物吡啶-BODIPY，進一步通過碘甲烷對吡啶進行修飾，合成了吡啶鹽-BODIPY。該化合物展現(xiàn)出熒光量子產(chǎn)率高，細胞毒性低、穩(wěn)定性好的優(yōu)勢，并且具有線粒體靶向功能，是一種非常優(yōu)秀的線粒體靶向熒光母體。因此，使用吡啶鹽-BODIPY對二碳基配體進行修飾，合成得到了化合物PBT；通過核磁氫譜、碳譜對化合物進行了表征；利用MTT實驗研究了PBT對人肺腺癌細胞(H1975)的細胞毒性；并使用激光共聚焦顯微成像技術(shù)研究PBT的線粒體靶向能力。上述研究表明，PBT是一種生物相容性好、光物理性質(zhì)穩(wěn)定的新型線粒體靶向熒光載體，該研究對線粒體靶向藥物的研發(fā)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ZF-6型三用紫外分析儀(鞏義市予華儀器有限責任公司)，日立F-4500型熒光分光光度計(日本日立)；400M型核磁共振儀(德國布魯克)；LCMS8040型液質(zhì)聯(lián)用儀(日本島津)；NOL-LSM 710型雙光子激光共聚焦顯微鏡(德國蔡司)；所用試劑均為分析純。

1.2 合成

以4-吡啶甲醛、2，4-二甲基吡咯、三氟化硼乙醚為原料，經(jīng)兩步反應合成熒光化合物1；1，4-二溴丁烷和對羥基苯乙酮在堿性條件下制備化合物2；化合物2進一步和三氟乙酸乙酯反應制備化合物3；化合物1和3在高溫回流的條件下制備得到目標化合物4(PBT)。圖1為PBT的合成路線。

圖1 載體化合物的合成路線圖

1.2.1 化合物1的合成

常溫下，將4-吡啶甲醛(428mg，4mmol)溶于400mL干燥二氯甲烷中，加入2，4-二甲基吡咯(760mg，8mmol)與催化劑三氟乙酸2滴，常溫反應8h。然后加入DDQ(908mg，4mmol)，常溫條件反應2h后加入8mL三乙胺和5mL三氟化硼乙醚，再常溫反應8h，反應結(jié)束，加入等量碳酸氫鈉溶液，萃取后取有機層，旋干得黑褐色油狀物質(zhì)。采用柱層析提純(400目硅膠)，洗脫劑比例(石油醚∶乙酸乙酯=5∶1，V/V)，得化合物1(390mg，產(chǎn)率30%)橙色固體。

1H NMR (400MHz，CDCl3)δ8.78(d，J=5.6Hz，1H)，7.30(d，J=5.7Hz，1H)，6.01(s，1H)，2.56(s，3H)，1.41(s，3H)。13CNMR(101MHz，CDCl3)δ156.45，150.67，143.55，142.67，137.66，130.34，123.29，121.82，77.42，77.10，76.78，14.62。

1.2.2 化合物2的合成

在500mL圓底燒瓶中加入N，N-二甲基甲酰胺(200mL)，再加入1，4-二溴丁烷(2.13g，10mmol)和無水碳酸鉀(1.38g，10mmol)，攪拌0.5h。再取對羥基苯乙酮(0.68g，5mmol)溶于30mL N，N-二甲基甲酰胺，將所得溶液添加至初始溶液中，常溫條件下繼續(xù)反應12h。反應液進行過濾，除去無水硫酸鉀固體，將濾液溶于兩倍體積水中，用等體積乙酸乙酯萃取兩次，合并有機層。無水硫酸鈉干燥有機層，過濾掉無水硫酸鈉，濃縮有機相，將濃縮液過柱層析柱(400目硅膠，展開劑：石油醚)，得化合物中間體(1.74g，產(chǎn)率80%)黃色油狀物。

在50mL圓底燒瓶中加入0.15g氫化鈉(50%)和10mL干燥的四氫呋喃，通入氮氣保護，置于冰浴中攪拌，緩慢滴加三氟乙酸乙酯(1.42g，10mmol)，攪拌10min。待溫度降到零攝氏度后，將第一步所得黃色油狀產(chǎn)物(2.56g，10mmol)溶于5mL四氫呋喃中，滴加至反應瓶中，滴完后，室溫條件下攪拌6h。反應液用50mL水淬滅，用30mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，用飽和食鹽水洗滌一次，取有機層干燥，旋干得黃色固體。過柱層析(400目硅膠，洗脫劑丙酮∶正乙烷=1∶6，V/V)，得產(chǎn)物化合物2(2.74g，產(chǎn)率75%)紅色晶體。

1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.92(d，J=8.9Hz，1H)，6.97(d，J=8.9Hz，1H)，6.50(s，1H)，4.09(t，J=5.9Hz，1H)，3.50(t，J=6.4Hz，1H)，2.14-2.04(m，1H)，2.04-1.94(m，1H)。13C NMR(101MHz，CDCl3)δ186.18，175.91，163.86，131.09，130.07，125.49，118.85，116.04，114.79，91.57，91.55，77.35，77.03，76.72，67.35，33.18，29.29，27.69。

1.2.3 化合物3(PBT)的合成

取吡啶鹽-BODIPY(0.36g，1mmol)和化合物2(0.367g，1mmol)于50mL圓底燒瓶，加入適量的甲苯，加熱回流過夜。反應產(chǎn)生紅色固體，用二氯甲烷重結(jié)晶，即可得到純品化合物PBT(0.28g，產(chǎn)率40%)。

1H NMR(400MHz，DMSO)δ 9.22(s，1H)，8.25(s，1H)，7.72(d，J=18.1Hz，1H)，6.90(d，J=47.0Hz，1H)，6.06(s，1H)，4.67(s，1H)，3.94(s，1H)，2.26(s，4H)，1.97(s，1H)，1.55(s，1H)，1.19(s，3H)。13C NMR(101MHz，DMSO-d6)δ195.57，185.92，172.54，163.07，157.33，151.28，146.57，142.91，135.16，131.70，130.69，130.37，129.92，129.45，128.90，122.92，114.89，114.69，93.13，92.81，67.69，61.21，44.51，42.41，40.53，40.32，40.11，39.90，39.69，39.48，39.28，28.13，25.45，21.53，15.24，14.79，8.96。

2 結(jié)果與討論

2.1 PBT的光物理性質(zhì)

PBT的光學性質(zhì)在甲醇溶液中以10μmol/L的濃度進行研究(如圖2所示)，現(xiàn)化合物PBT具有較好的光學性質(zhì)，其吸收波長最大為510nm，最大發(fā)射波長為585nm。

深色線條為紫外吸收光譜，淺色線條為熒光發(fā)射光譜

2.2 細胞毒性實驗

通過MTT法(具體步驟見表1)研究化合物3對人肺腺癌細胞(H1975)的生物活性。PBT的細胞毒性結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，PBT對H1975的生物活性影響較小，證明該配體毒性很小，具有較好的生物相容性。

表1 MTT法的具體步驟

圖3 化合物PBT的細胞活性圖

2.3 細胞線粒體定位實驗

將人宮頸癌細胞(HeLa)鋪于經(jīng)特殊處理的小皿內(nèi)，其具有良好透光性，待細胞貼壁后，換用含5μmol/L化合物3的培養(yǎng)基處理0.5h。棄培養(yǎng)基，加PBS，加入2μM MTR(MitoTracker?Red CM-H2XRos)對細胞線粒體進行染色標記。置于培養(yǎng)箱中37℃避光染色0.5h后，棄染色液，加入PBS，利用共聚焦顯微鏡對熒光信號進行檢測，并記錄結(jié)果。

在共焦激光掃描顯微鏡下研究了化合物PBT細胞線粒體定位能力(見圖4，封二)。如圖4所示，化合物PBT具有綠色熒光信號，線粒體熒光染料具有紅色熒光信號，且化合物PBT產(chǎn)生的綠色熒光信號與線粒體熒光染料產(chǎn)生的紅色熒光信號完全重疊?；衔颬BT的細胞線粒體定位實驗表明，其在細胞內(nèi)主要集中的細胞器是線粒體，具有線粒體靶向特性，能在細胞線粒體中選擇性集聚。化合物PBT在細胞中具有良好的線粒體靶向特性和亞細胞實時成像能力。

3 結(jié) 論

以吡啶鹽-BODIPY為熒光母體修飾二碳基配體，合成得到線粒體靶向載體PBT，通過核磁氫譜和碳譜明確了化合物結(jié)構(gòu)。進一步，用過紫外和熒光分光光度計研究了化學PBT的光物理性質(zhì)。通過MTT實驗評估的化合物的細胞毒性，發(fā)現(xiàn)化合物的細胞毒性極低，具有非常好的生物相容性。在此基礎(chǔ)上，通過激光共聚焦顯微成像技術(shù)，使用線粒體商品染料MTR，研究PBT的細胞成像及亞細胞的定位能力，發(fā)現(xiàn)化合物具有較好的線粒體定位成像能力。綜上，化合物具有生物相容性好，光物理性質(zhì)穩(wěn)定，能靶向進入線粒體，是一例非常優(yōu)秀的線粒體靶向載體。PBT分子中獨特的二羰基結(jié)構(gòu)可以負載鉑等稀土化合物，可以用于線粒體熒光探針及線粒體靶向抗腫瘤藥物的合成。