魯 穎譚永生姚茂君楊 茜孫 雯

(1. 吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000；2. 吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南 吉首 416000；3. 湘西自治州質(zhì)量檢驗(yàn)及計(jì)量檢定中心，湖南 吉首 416000)

黃金茶是湘西特有的珍稀地方茶樹品種資源[1]，其氨基酸含量和水浸出物含量分別為7.47%，41.04%，高出同期其他綠茶，而茶多酚含量?jī)H為18.04%[2]，高浸出物和低酚氨比的優(yōu)異特性使得黃金茶成為生產(chǎn)抹茶的優(yōu)質(zhì)原料[3]。色澤是評(píng)判抹茶品質(zhì)等級(jí)的重要因素，翠綠的色澤是高品質(zhì)抹茶所必須具備的[4-5]。但在抹茶加工過程中，葉綠素易受光、熱、pH等外界因素的影響而發(fā)生褪色或變色[6]，顯著影響抹茶品質(zhì)。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)果蔬護(hù)綠進(jìn)行了大量研究，而對(duì)茶葉的護(hù)綠工藝卻鮮見報(bào)道。果蔬加工中常將物理漂燙作為控制酶促褐變的預(yù)處理方法，以保證產(chǎn)品具備良好的色澤和感觀[7-9]。而抹茶通常使用物理蒸青來鈍化酶的活性，其主要是利用蒸汽穿透葉層，使葉溫迅速升高，從而達(dá)到加速葉中酶鈍化的效果，最大程度地減少葉綠素等內(nèi)含成分的損失[10-11]。常用的化學(xué)護(hù)綠方法主要有堿液浸泡、各類護(hù)綠劑(如抗壞血酸、金屬離子化合物、葉綠素銅鈉鹽等)處理等[12-14]。銅、鋅等金屬離子處理方法受元素殘留等食品安全性問題的影響，使用受到限制[15]；葉綠素銅鈉鹽等護(hù)綠劑染色法成本較高，在實(shí)際應(yīng)用中較少使用[16]。而堿液處理可使葉綠素發(fā)生水解皂化反應(yīng)，生成綠色葉綠素鈉鹽[17]，且能除去黃金茶表面的蠟?zāi)だ谧o(hù)綠劑的滲透，達(dá)到良好的護(hù)綠效果[18]。該方法護(hù)綠效果明顯、操作簡(jiǎn)單易行、無食品安全性問題，因此被廣泛應(yīng)用于果蔬的護(hù)綠工藝中。研究擬以黃金茶為原料，結(jié)合蒸汽殺青和堿液浸泡的護(hù)綠方式研制色澤翠綠的高品質(zhì)黃金抹茶。利用Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)篩選出顯著因素[19]，通過最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)確定最佳護(hù)綠工藝，并對(duì)黃金抹茶進(jìn)行品質(zhì)研究，以期為黃金茶開發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃金茶葉：湘西匯豐農(nóng)業(yè)有限公司；

無水乙醇、丙酮：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

碳酸鈣、無水碳酸氫鈉：分析純，麥克林試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見—分光光度計(jì)：UV-2450型，日本島津公司；

電子天平：FA224型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

鼓風(fēng)干燥箱：GZX-9246MBE型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

高速中藥粉碎機(jī)：ZN-400A型，上海元析儀器有限公司；

行星式球磨機(jī)：KQM-X4型，咸陽金宏通用機(jī)械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 堿液浸泡蒸青護(hù)綠法制備黃金抹茶 統(tǒng)一人工采摘經(jīng)過遮陰覆蓋的一芽?jī)扇~黃金茶，選擇大小均一，色澤均勻，成熟度一致，無傷、無病蟲害的茶葉，經(jīng)無水碳酸氫鈉溶液浸泡后迅速用流動(dòng)水沖洗，備用。放入蒸汽器具隔板中進(jìn)行蒸青處理，保持蒸青器具溫度和鍋內(nèi)壓力一致，以控制所有批次的蒸汽量一致。蒸青后取出，置于鼓風(fēng)干燥箱中烘干(80 ℃)，直至恒重。最后將烘干后的茶葉置于高速中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粗粉碎，再用行星式球磨機(jī)進(jìn)行超微粉碎。

1.2.2 黃金抹茶堿液浸泡蒸青護(hù)綠的工藝優(yōu)化

(1) Plackett-Burman試驗(yàn)：利用Plackett-Burman試驗(yàn)考察堿液質(zhì)量百分濃度、料液比、蒸青葉層厚度、堿液浸泡時(shí)間、蒸青時(shí)間5個(gè)因素對(duì)黃金抹茶葉綠素含量的影響，篩選出具有顯著影響的關(guān)鍵因素。每個(gè)因素取高(+1)、低(-1) 2個(gè)水平。

(2) 最陡爬坡試驗(yàn)：根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)得到的一次擬合方程，設(shè)計(jì)各關(guān)鍵因素爬坡方向和步長(zhǎng)，使得具有顯著影響的關(guān)鍵因素取值逼近最大響應(yīng)區(qū)域，確定各重要因素最佳中心點(diǎn)[20]。

(3) 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)：根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)篩選出的顯著性關(guān)鍵因素進(jìn)行響應(yīng)面(Box-Behnken)設(shè)計(jì)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果建立自變量數(shù)學(xué)模型，并根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖。

1.2.3 不同加工方式對(duì)比 采用同一批鮮葉原料，經(jīng)3種不同加工處理后，比較得到的黃金抹茶葉綠素、茶多酚、茶氨酸、酚氨比、水浸出物含量及感觀評(píng)價(jià)。

(1) 傳統(tǒng)蒸青(方式A)：參照1.2.1的方法，但不對(duì)采摘后的黃金茶鮮葉進(jìn)行堿液浸泡和護(hù)綠劑處理，直接采用蒸汽殺青，干燥后超微粉碎得到黃金抹茶。

(2) 滾筒殺青(方式B)：設(shè)置殺青溫度145 ℃，時(shí)間2.5 min，將殺青葉干燥粉碎得到黃金抹茶。

(3) 堿液浸泡蒸青(方式C)：用經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后得到的最優(yōu)工藝制備黃金抹茶。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

(1) 葉綠素含量：參照肖潤(rùn)林等[21]的方法，稍作修改。用V丙酮∶V無不乙醇∶V蒸餾水=4.5∶4.5∶1.0的丙酮—無水乙醇—蒸餾水混合液提取黃金抹茶葉綠素，分別在645 nm和663 nm 處測(cè)定吸光度值，按式(1)和式(2)計(jì)算葉綠素含量。

c=(12.70×A663 nm-2.69×A645 nm)+(22.90×A645 nm-4.68×A663 nm)，

(1)

(2)

式中：

A663 nm——提取液在663 nm處的吸光度值；

A645 nm——提取液在645 nm處的吸光度值；

ω——葉綠素含量，mg/g；

c——葉綠素濃度，mg/mL；

v——提取液體積，mL；

m——樣品鮮重，g。

(2) 茶多酚含量：參照GB/T 8313—2018，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=0.074 8+0.009 2X，R2=0.998 4)，先準(zhǔn)確吸取測(cè)試液各1.0 mL，再加入5.0 mL 的福林酚試劑，搖勻。待反應(yīng)3～8 min后，加入4.0 mL 7.5% 碳酸鈉溶液，加水定容至25 mL。室溫下放置60 min 后在765 nm條件下用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算茶多酚含量。

(3) 游離氨基酸含量：參照GB/T 8314—2013，以谷氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=-0.259 6+2.651X，R2=0.999 1)，在比色皿中分別吸取1.0 mL測(cè)試液、0.5 mL pH 8.0磷酸鹽緩沖液和0.5 mL 2%茚三酮溶液，沸水浴中加熱15 min，待冷卻后加水定容至25 mL，在570 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算游離氨基酸含量。

(4) 水浸出物含量：參照GB/T 8305—2013，將黃金抹茶沸水浴浸提后趁熱減壓過濾，用沸蒸餾水洗滌數(shù)次后將茶渣連同濾紙移入烘皿后立即干燥直至恒重，最后稱量計(jì)算結(jié)果。

(5) 感官評(píng)定：參照Ikeda等[22]和李東娜等[23]的方法，稱取3.0 g抹茶，用80 ℃水在白瓷審評(píng)碗中沖泡5 min，由10位有經(jīng)驗(yàn)的審評(píng)員采用密碼審評(píng)法，對(duì)茶樣的色澤、湯色、香氣和滋味進(jìn)行感官評(píng)分，其中色澤評(píng)分、湯色評(píng)分、香氣評(píng)分、滋味評(píng)分分別占總分的30%，10%，30%，30%。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次或3次以上，結(jié)果用平均值表示，運(yùn)用Excel 2003、Origin 9.0以及Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選關(guān)鍵因素

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察堿液質(zhì)量百分濃度、料液比、蒸青葉層厚度、堿液浸泡時(shí)間、蒸青時(shí)間5個(gè)因素對(duì)葉綠素含量的影響，并篩選出顯著影響因素，各因素的水平取值及試驗(yàn)結(jié)果見表1和表2。

根據(jù)表2的結(jié)果對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到對(duì)黃金抹茶葉綠素含量影響的一次回歸方程：

Y=2.080+0.051X1+0.021X2-2.282×10-3X3+0.024X4-0.026X5。

(3)

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素及水平取值

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析?

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)確定最佳中心點(diǎn)

根據(jù)3個(gè)顯著因素的系數(shù)設(shè)計(jì)爬坡方向和步長(zhǎng)，其中堿液質(zhì)量百分濃度、堿液浸泡時(shí)間為正效應(yīng)，取其高水平；蒸青時(shí)間為負(fù)效應(yīng)，取其低水平。表4為最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。

表4結(jié)果表明黃金抹茶葉綠素含量在第3組達(dá)到最高，說明最優(yōu)點(diǎn)存在于第3組附近。因此以堿液質(zhì)量百分濃度為0.15%、浸泡時(shí)間20 min、蒸青時(shí)間90 s為響應(yīng)面試驗(yàn)中心點(diǎn)，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化分析

以堿液質(zhì)量百分濃度、堿液浸泡時(shí)間和蒸青時(shí)間為自變量，葉綠素含量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，護(hù)綠工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表5，結(jié)果見表6。

利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸方程擬合和方差分析，得到自變量的二次項(xiàng)回歸程：

(4)

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平取值

圖1(a)和(b)顯示蒸青時(shí)間為0水平時(shí)，隨著堿液質(zhì)量百分濃度從0.10%增加到0.20%，堿液浸泡時(shí)間從75 s增加到105 s，葉綠素含量先上升后下降。圖1(c)和(d)顯示堿液浸泡時(shí)間為0水平時(shí)，葉綠素含量隨堿液質(zhì)量百分濃度及浸泡時(shí)間的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)。圖1(e)和(f)顯示葉綠素含量隨堿液浸泡時(shí)間和蒸青時(shí)間的增加也呈先增加后降低的趨勢(shì)。

通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化分析得出的最佳工藝為堿液質(zhì)量百分濃度0.16%，堿液浸泡時(shí)間20.33 min，蒸青時(shí)間92 s。為了在實(shí)際操作中的便利性，將最佳工藝修正為堿液質(zhì)量百分濃度0.15%，堿液浸泡時(shí)間20 min，蒸青時(shí)間92 s，蒸青葉層厚度1 cm，料液比(m黃金茶∶V堿液)為1∶20 (g/mL)。為驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性，采用上述所得最佳工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，葉綠素平均含量為2.25 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值基本符合，說明該回歸方程能夠真實(shí)地反映各因素對(duì)黃金抹茶葉綠素含量的影響。

2.4 不同加工方式黃金抹茶品質(zhì)比較

2.4.1 主要化學(xué)成分 如表8所示，與傳統(tǒng)蒸青和滾筒殺青相比，堿液浸泡蒸青黃金抹茶的葉綠素含量分別提高了25.78%，40.44%；與滾筒殺青相比，傳統(tǒng)蒸青和堿液浸泡蒸青黃金抹茶的茶多酚含量增加4.44%，7.10%，游離氨基酸含量增加11.91%，9.97%，而傳統(tǒng)蒸青與堿液浸泡蒸青之間無顯著差異；3種方式制備的黃金抹茶水浸出物含量存在顯著性差異?？赡茉蚴牵辞鄷r(shí)茶葉升溫較慢，破壞酶活性的時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)鮮葉與高溫筒壁接觸摩擦，使得葉綠素破壞量較多；蒸汽殺青過程中茶鮮葉在短時(shí)間內(nèi)被高溫蒸汽穿透，迅速地破壞酶活使葉綠素保留下來。經(jīng)堿液浸泡的抹茶葉綠素含量更高，堿性環(huán)境使得葉綠素在高溫的殺青過程中受到保護(hù)，保證抹茶翠綠的色澤。茶多酚和游離氨基酸是決定抹茶滋味的重要物質(zhì)，酚氨比低的抹茶滋味更加鮮爽。由表8可知，傳統(tǒng)蒸青的黃金抹茶的酚氨比最高，堿液浸泡蒸青處理的其次，但與傳統(tǒng)蒸青的無顯著差異。綜上，蒸汽殺青相比于滾筒殺青能較大程度地保留抹茶主要內(nèi)含物質(zhì)，而堿液浸泡在蒸青的基礎(chǔ)上進(jìn)一步減少了葉綠素的損失，保證了高品質(zhì)抹茶翠綠的色澤，且不會(huì)對(duì)茶多酚、游離氨基酸等其他內(nèi)含物造成不良影響。

表6 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表7 回歸模型方差分析及結(jié)果?

圖1 兩因素間交互作用響應(yīng)面及其等高線圖

2.4.2 感官品質(zhì) 由表9可知：抹茶色澤差異較明顯，堿液浸泡蒸青抹茶外觀色澤翠綠明亮，傳統(tǒng)蒸青抹茶次之，而炒青抹茶整體色澤偏黃、欠明，與上述成分分析中葉綠素含量的變化相符合。蒸汽殺青的滋味較為醇和，而炒青的滋味平和略澀，還帶有高火和焦味。傳統(tǒng)蒸汽殺青所需時(shí)間短、受熱較為均勻且盡可能避免了茶葉與傳熱儀器的摩擦接觸，保證了抹茶較為純正的香味，堿液浸泡前處理對(duì)其影響不大，但與炒青相比差異明顯。

表8 黃金抹茶品質(zhì)比較?

表9 黃金抹茶品質(zhì)的感官評(píng)分結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)最終得到的堿液浸泡蒸青最佳護(hù)綠工藝為：堿液質(zhì)量百分濃度0.15%，堿液浸泡時(shí)間20 min，蒸青時(shí)間92 s，蒸青葉層厚度1 cm，料液比(m黃金茶∶V堿液)1∶20 (g/mL)。堿液浸泡蒸青護(hù)綠工藝可顯著提高黃金抹茶葉綠素含量，與傳統(tǒng)蒸青和滾筒殺青所得黃金抹茶相比，葉綠素含量分別提高了25.78%，40.44%；且不會(huì)對(duì)蒸青過程中其他內(nèi)含成分造成不良影響，感觀品質(zhì)好。試驗(yàn)從工藝優(yōu)化角度對(duì)黃金抹茶護(hù)綠工藝進(jìn)行了研究，但未能對(duì)研制過程中葉綠素降解機(jī)理及其他護(hù)綠作用機(jī)制進(jìn)行深入探究，后續(xù)可對(duì)此進(jìn)行研究并探討其作用機(jī)制。