林文忠，吳然，金晶，丘萍，張潔，吳祖建，杜振國(guó)

基于粗提物的水稻條紋病毒體外“抓帽”體系

林文忠，吳然，金晶，丘萍，張潔，吳祖建，杜振國(guó)

（福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所/閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

布尼亞病毒目（）和正黏病毒科（）病毒從帽子結(jié)構(gòu)下游10—20個(gè)堿基處切割寄主mRNA，以5′端切割產(chǎn)物（帽子序列）作為引物起始自身基因組的轉(zhuǎn)錄，生成含一段異源帽子序列的病毒mRNA，這一過(guò)程稱(chēng)為“抓帽”。水稻條紋病毒（rice stripe tenuivirus, RSV）是一種布尼亞病毒，其“抓帽”機(jī)制還不甚清楚。【】研究RSV粗提物能否從溶液中的外源mRNA“抓帽”，以建立一種便捷的體外體系，用于解析RSV“抓帽”和轉(zhuǎn)錄機(jī)制。以PEG沉淀和超速離心法粗提RSV，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和質(zhì)譜技術(shù)分析粗提物成分。然后取少量粗提液，加入富含珠蛋白（）mRNA的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液（rabbit reticulocyte lysate，RCL）和合適濃度的金屬離子配制體外“抓帽”體系。待體外反應(yīng)結(jié)束，提取體系中總RNA，以巢式RT-PCR擴(kuò)增含珠蛋白-mRNA帽子序列的RSV mRNA，并對(duì)其進(jìn)行克隆，通過(guò)序列分析比較RSV體外“抓帽”與體內(nèi)“抓帽”的異同。從100 g感染RSV的水稻葉片獲得RSV粗提液2 mL。除RSV病毒粒子外，粗提液中還含核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶等多種葉綠體蛋白。取2 μL粗提液，加入4 mmol·L-1MgCl2、2 mmol·L-1NTP、0.8 U·μL-1RNA酶抑制劑和8 μL RCL，配成20 μL反應(yīng)體系，30℃孵育1.5 h后，巢式RT-PCR擴(kuò)增到了目的條帶，表明RSV粗提物能切割溶液中的珠蛋白-mRNA，并利用其帽子序列合成自身mRNA。在反應(yīng)體系中加入帽子結(jié)構(gòu)類(lèi)似物m7G（5′）ppp（5′）G后進(jìn)行相同反應(yīng)，目的條帶變淡，且變淡程度與所加入m7G（5′）ppp（5′）G的濃度成正比，表明識(shí)別帽子結(jié)構(gòu)是RSV從溶液中切割利用珠蛋白-mRNA的前提。對(duì)巢式RT-PCR產(chǎn)物克隆和測(cè)序后分析發(fā)現(xiàn)，與在體內(nèi)的情況類(lèi)似，RSV從帽子結(jié)構(gòu)下游的A或C處切割珠蛋白-mRNA，得到的帽子序列與病毒模板鏈3′端的U或G配對(duì)后引發(fā)轉(zhuǎn)錄。在利用珠蛋白-mRNA帽子序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中，RSV頻繁使用引發(fā)與重配，且在合成核蛋白基因時(shí)比在合成主要非核蛋白基因時(shí)使用該機(jī)制的頻率更高。RSV粗提物能從溶液中的mRNA“抓帽”，且在切取和利用帽子序列的方式上，其表現(xiàn)與細(xì)胞內(nèi)的RSV無(wú)明顯差別。因而，粗提物可以用來(lái)解析RSV的“抓帽”機(jī)制，甚至用于研究RSV的轉(zhuǎn)錄。

水稻條紋病毒；抓帽機(jī)制；體外轉(zhuǎn)錄

0 引言

【研究意義】水稻條紋病毒（rice stripe tenuivirus，RSV）是我國(guó)最重要的糧食作物病毒之一，深入認(rèn)識(shí)RSV侵染機(jī)理，實(shí)現(xiàn)RSV的可持續(xù)防控，是關(guān)系到我國(guó)糧食安全的重大需求[1-2]。作為基因表達(dá)的第一步，“抓帽”（cap-snatching）是RSV侵染周期中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一[3]。建立一種便捷的體外體系，有助于深入研究RSV的“抓帽”機(jī)制?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】真核生物信使RNA（mRNA）5′端有一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)，能保護(hù)mRNA免受5′到3′外切酶降解的同時(shí)，在mRNA的翻譯起始等過(guò)程中也起重要作用[4]。除非有一些替代機(jī)制，病毒也需要給自己的mRNA添加帽子結(jié)構(gòu)。病毒以多種不同的機(jī)制實(shí)現(xiàn)這一目的，其中布尼亞病毒目（）和正黏病毒科（）病毒普遍采用“抓帽”。在此過(guò)程中，它們從帽子結(jié)構(gòu)下游10—20個(gè)堿基處切割寄主mRNA，然后利用5′端切割產(chǎn)物（帽子序列）作為病毒模板鏈的轉(zhuǎn)錄引物，使每條病毒mRNA都含一小段來(lái)源于寄主mRNA的帽子序列[5]。“抓帽”現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于流感病毒（正黏病毒科），迄今為止研究最多的也是該病毒[6-7]。相應(yīng)地，“抓帽”已成為抗流感病毒藥物開(kāi)發(fā)的一個(gè)重要靶標(biāo)[8]。RSV是布尼亞病毒目白纖病毒科（）纖細(xì)病毒屬（）的代表種，自然條件下由灰飛虱（）以持久增殖型方式傳播，主要侵染水稻和小麥等禾本科作物[9-10]，實(shí)驗(yàn)室條件下，也可以通過(guò)機(jī)械接種或昆蟲(chóng)傳毒方式侵染模式植物本氏煙和擬南芥[11-12]。RSV基因組由4條單鏈RNA（ssRNA）組成，按分子量大小分別稱(chēng)為RNA1—RNA4。RNA1—RNA4在5′和3′末端有一段保守的反向互補(bǔ)序列，分別為5′-A1C2A3C4AAAGUC-和3′-U1G2U3G4UUUCAG-。RNA1采用負(fù)義編碼，而RNA2—RNA4采用雙義編碼，即它們的病毒鏈（vRNA）和互補(bǔ)鏈（vcRNA）都可以作為轉(zhuǎn)錄的模板[9-10]。Shimizu等[13]最先克隆了RSV的mRNA，發(fā)現(xiàn)它們除拷貝自基因組的序列（下稱(chēng)拷貝序列），還含一段異源帽子序列，表明RSV使用“抓帽”機(jī)制；Yao等[14]以RSV與黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）共侵染本氏煙，發(fā)現(xiàn)RSV可從CMV抓取帽子序列。對(duì)RSV從CMV“抓帽”后合成的mRNA進(jìn)行克隆和分析發(fā)現(xiàn)，大部分RSV mRNA在帽子序列和拷貝序列之間含一個(gè)或多個(gè)AC重復(fù)，表明RSV在利用從CMV抓取的帽子序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，頻繁使用引發(fā)與重配（prime- and-realign）機(jī)制[14-15]。RSV使用引發(fā)與重配機(jī)制的頻率與帽子序列的長(zhǎng)短有關(guān)，帽子序列越短，使用該機(jī)制的頻率越高。本實(shí)驗(yàn)室首次對(duì)RSV mRNA進(jìn)行了5′端的高通量測(cè)序，并根據(jù)所得數(shù)據(jù)，提出了RSV“抓帽”的基本模型[16]。在RSV侵染的本氏煙葉片浸潤(rùn)含pCHF3載體的農(nóng)桿菌，RSV會(huì)從pCHF3表達(dá)的mRNA“抓帽”?；诖?，近期建立了一種向RSV呈遞特定mRNA（供其“抓帽”）的實(shí)驗(yàn)體系，并應(yīng)用該體系初步驗(yàn)證了RSV“抓帽”的基本模型[17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)RSV“抓帽”機(jī)制的很多細(xì)節(jié)還不清楚。體外“抓帽”體系在解析流感病毒“抓帽”機(jī)制的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，在一些布尼亞病毒上也有成功的應(yīng)用[18-21]。利用這一體系，研究者可以定量地向病毒提供特定mRNA，甚至特定的帽子序列，以研究病毒如何選擇和利用帽子序列[22-26]。顯然，這樣的體系對(duì)RSV“抓帽”和轉(zhuǎn)錄機(jī)制研究也具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】確定RSV粗提物能否從外源mRNA“抓帽”，并研究RSV體外“抓帽”與體內(nèi)“抓帽”在方式上是否存在差異。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年6月至2020年5月間在福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所完成。

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試毒株與植物 攜帶RSV的灰飛虱由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院季英華研究員提供，引入本實(shí)驗(yàn)室后，在水稻上繼代培養(yǎng)。帶毒灰飛虱取食過(guò)的水稻幼苗種植于日光溫室，出現(xiàn)典型RSV感染癥狀后用于RSV的提取。

1.1.2 主要試劑 主要試劑及其來(lái)源見(jiàn)表1，其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RSV的粗提和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè) 取感染RSV的新鮮水稻葉片約100 g，剪碎后加入研缽，以液氮浸沒(méi)并迅速研磨至粉末狀。隨后參照Wang等[27]描述的步驟提取RSV，以0.01 mol·L-1PBS緩沖液（0.27 g·L-1KH2PO4，1.42 g·L-1Na2HPO4，8 g·L-1NaCl，0.2 g·L-1KCl，pH 7.4）代替了文獻(xiàn)[27]中的PB緩沖液。最終提取物以2 mL PBS溶解，分裝后置于-80℃冰箱備用。

為了解RSV粗提物的蛋白組分，取粗提液80 μL，加入5×蛋白上樣緩沖液20 μL，混合均勻后，沸水浴5 min，于恒壓120 V下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，5%濃縮膠，12%分離膠）。每孔上樣20 μL，以6 μL Direct-loadTMColor Prestained Protein Marker（GenStar）作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳完畢，凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色和脫色液脫色后用相機(jī)進(jìn)行拍照，并割取主要蛋白條帶，送上海啟研生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

表1 本研究所用的主要試劑和試劑盒

1.2.2 體外“抓帽”反應(yīng)體系 RSV體外“抓帽”體系參照Van Knippenberg等[28]的報(bào)道略有改動(dòng)，含2 μL RSV粗提液，8 μL兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液（rabbit reticulocyte lysate，RCL），4 mmol·L-1MgCl2，2 mmol·L-1NTP及0.8 U·μL-1RNA酶抑制劑，總體積20 μL，30℃下恒溫孵育1.5 h。

1.2.3 體外“抓帽”所產(chǎn)生的RSV mRNA的巢式RT-PCR檢測(cè)和克隆測(cè)序 上述反應(yīng)完成后，以RNA純化試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行純化，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，純化產(chǎn)物以15 μL RNAase-free去離子水溶解。RCL中含大量珠蛋白-和珠蛋白-mRNA，本研究?jī)H擴(kuò)增了RSV從珠蛋白-抓帽后的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。所用巢式RT-PCR基本原理如圖1所示，以primer 1合成第一鏈，然后以primer 2和3擴(kuò)增cDNA。Primer 3的3′末端10個(gè)堿基與珠蛋白-mRNA最5′端10個(gè)堿基相同，5′端15個(gè)堿基（下劃線部分）主要作用是增加引物長(zhǎng)度。RSV共轉(zhuǎn)錄7種不同的mRNA，本文僅擴(kuò)增了其vRNA3的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和vcRNA4的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[29-30]。擴(kuò)增和所用的primer 1和2如圖1所示。反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 2 μL（約0.6 μg），primer 1 0.25 μmol·L-1，HiScript? II Enzyme Mix 2 μL，10×RT Mix 2 μL，總體積20 μL。反轉(zhuǎn)錄程序參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR體系：cDNA 2 μL，primer 2和3各0.5 μmol·L-1，2×ExTaq Mix 12.5 μL，總體積25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min后，按照94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，進(jìn)行31次循環(huán)，最后于72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像儀下觀察目的條帶。需要時(shí)切割目的條帶，以HiPure Gel Pure DNA Mini Kit進(jìn)行DNA回收，回收產(chǎn)物連接pMD19-T后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并挑取20—30個(gè)單菌落進(jìn)行測(cè)序。作為對(duì)照，除以圖1所示的巢式RT-PCR擴(kuò)增RSV mRNA，還擴(kuò)增了RSV的vcRNA3和vRNA4。其基本流程與巢式RT-PCR相同，但以病毒自身序列特異性引物取代了圖1所示的primer 3 （vcRNA3：5′-GCTACAATGGGCACCAACAAGC-3′；vRNA4：5′-AGATGCAAGACGTACAAAGGAC-3′）。

圖1 利用巢式RT-PCR擴(kuò)增RSV從珠蛋白-α“抓帽”后合成的NP（轉(zhuǎn)錄自vRNA3）和NCP（轉(zhuǎn)錄自vcRNA4）mRNA

2 結(jié)果

2.1 RSV粗提物的獲得

從100 g感染RSV的水稻葉片獲得RSV粗提液2 mL。取少量粗提液進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色后可觀察到4條主要的蛋白條帶，分子量依次約250、50、30和11 kD（圖2）。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，條帶1主要為光系統(tǒng)II相關(guān)蛋白，條帶2主要為核酮糖1,5-二磷酸羧化酶（RuBisCO）大亞基和RuBisCO活化酶，條帶3主要為RSV的NP，條帶4主要為RuBisCO小亞基。由這些結(jié)果可知，RSV粗提物含大量雜質(zhì)，而葉綠體是雜質(zhì)成分的重要來(lái)源。RNA1編碼的RdRp也是RSV的結(jié)構(gòu)蛋白[31]，但可能因?yàn)楹刻?，未觀察到該蛋白對(duì)應(yīng)的條帶。

Band 1—4：4個(gè)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定的主要蛋白條帶The 4 protein bands subjected to mass spectrometry

2.2 RSV粗提物“抓帽”產(chǎn)物的檢測(cè)

取體外“抓帽”反應(yīng)產(chǎn)物，用巢式RT-PCR擴(kuò)增含珠蛋白-mRNA帽子序列的RSV和mRNA，均能得到目的條帶。與病毒粒子中含更多的vRNA相符，（vRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）條帶明顯亮于（vcRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）條帶（圖3-A）。作為對(duì)照，以95℃熱失活2 min的RSV粗提液配制反應(yīng)體系，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行同樣的檢測(cè)，未觀察到目的條帶。無(wú)論是否對(duì)RSV粗提液進(jìn)行熱失活，反應(yīng)結(jié)束后均能檢測(cè)到RSV基因組RNA（圖3-A）。上述結(jié)果表明粗提液中的RSV能利用溶液中的mRNA作為帽子序列供體合成自身mRNA，且這種能力需要有活性的RSV蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)。

為驗(yàn)證RSV需要識(shí)別帽子結(jié)構(gòu)才能利用溶液中的mRNA作為帽子序列供體，在反應(yīng)體系中加入了不同濃度的帽子結(jié)構(gòu)類(lèi)似物m7G (5′) ppp (5′) G。如圖3-B所示，m7G (5′) ppp (5′) G明顯減少含珠蛋白-mRNA帽子序列的的生成。當(dāng)m7G (5′) ppp (5′) G濃度為1.5 mmol·L-1時(shí)，目的條帶基本消失。相反，m7G (5′) ppp (5′) G對(duì)反應(yīng)后的RSV基因組RNA的檢出性沒(méi)有影響，表明m7G (5′) ppp (5′) G不會(huì)造成反應(yīng)體系中RNA的降解。

M：DNA marker。A：以正?；驘崾Щ頡SV粗提物進(jìn)行體外“抓帽”，然后利用巢式RT-PCR擴(kuò)增含珠蛋白-α帽子序列的RSV NCP（孔1和3）或NP（孔2和4） mRNA，以RT-PCR擴(kuò)增vcRNA4上NCP對(duì)應(yīng)區(qū)域（孔6和8）或vRNA3上NP對(duì)應(yīng)區(qū)域（孔5和7）Untreated or heat inactivated RSV crude preparations were used in the in vitro cap-snatching assay. Nested RT-PCR was used to detect RSV NCP (lanes 1 and 3) or NP (lanes 2 and 4) mRNAs with capped-RNA leaders derived from globin-α. RT-PCR was used to detect a NP-corresponding region on RSV vRNA3 (lanes 5 and 7) or a NCP-corresponding region on RSV vcRNA4 (lanes 6 and 8)；B：在0—1.5 mmol·L-1帽子類(lèi)似物m7G (5′) ppp (5′) G存在下進(jìn)行體外“抓帽”，然后以巢式RT-PCR擴(kuò)增含珠蛋白-α帽子序列的RSV NCP（孔1—4），以RT-PCR擴(kuò)增vcRNA4上NCP對(duì)應(yīng)區(qū)域（孔5—8）The cap analog m7G (5′) ppp (5′) G was added at a final concentration of 0.5, 1 or 1.5 mmol·L-1. Nested RT-PCR was used to detect RSV NCP with capped-RNA leaders derived from globin-α (lanes 1 to 4) and RT-PCR was used to detect a NCP-corresponding region on RSV vcRNA4

2.3 RSV粗提物“抓帽”產(chǎn)物分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證RSV粗提物能從外源mRNA“抓帽”，并分析這種情況下產(chǎn)生的RSV mRNA，對(duì)圖3-A中Lane 1和2的目的條帶進(jìn)行了割膠回收。經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化和挑取單克隆測(cè)序后，得到RSVmRNA序列19條，含非冗余單一序列7條（表2），mRNA序列28條，含非冗余單一序列6條（表3）。

分析發(fā)現(xiàn)，這些序列都可用之前通過(guò)體內(nèi)研究提出的模型解釋[16-17]：（1）RSV從C12或C18切割珠蛋白-mRNA，得到末端為C的帽子序列mG---C。該帽子序列與RSV基因組3′端G2配對(duì)后從U3引發(fā)轉(zhuǎn)錄，生成m7G---CAC。m7G---CAC可以繼續(xù)按照模板延伸，直至生成完整的RSV mRNAm7G---（表3，第一行，下劃線部分為能Map到病毒基因組的堿基），也可以與模板鏈脫離，以新延伸出的AC與RSV基因組3′端的U1G2配對(duì)，重新從U3引發(fā)轉(zhuǎn)錄，即發(fā)生引發(fā)與重配（圖4-A）。引發(fā)與重配可發(fā)生多次，其結(jié)果是RSV mRNA在帽子序列與所謂的拷貝序列之間出現(xiàn)1或多個(gè)AC重復(fù)（表2第2、4和5行及表3的第3行）；（2）除C12或C18外，RSV還可以在A14切割珠蛋白-mRNA，得到末端為A的帽子序列m7G---C13A14。該帽子序列可以利用A14與RSV基因組3′端的U1配對(duì)，或利用C13A14與RSV基因組3′端的G2U3配對(duì)（圖4-B、4-C）。同樣，在轉(zhuǎn)錄起始之后，RSV可以使用0到多次引發(fā)與重配，生成多種不同形式的RSV mRNA。按照這種解釋?zhuān)琑SV利用珠蛋白-mRNA帽子序列生成（58%）時(shí)比生成（33%）時(shí)更頻繁使用引發(fā)與重配，這與之前的發(fā)現(xiàn)也完全相符[16]。

陰影部分表示對(duì)應(yīng)珠蛋白-mRNA的序列，下劃線部分表示能Map到RSV基因組（3′-U1G2U3G4UUUCAG-）的堿基；加黑字體表示因引發(fā)與重配而生成的額外堿基；“+”表示有發(fā)生引發(fā)與重配；“-”表示沒(méi)有發(fā)生引發(fā)與重配。表3同

RSV mRNA nucleotides that can be mapped to the 5′-terminus of globin-mRNA are dashed, and those can be mapped to the genome of RSV (3′-U1G2U3G4UUUCAG-) are underlined. Nucleotides produced by priming and realignment are in bold. The symbol “+” indicates that the sequence can be explained by at least one round of priming and realignment, whereas “-” indicates that the sequence might be produced without priming and realignment. The same as Table 3

表3 RSV從珠蛋白-α mRNA“抓帽”后生成的NCP mRNA

A：帽子序列與RSV基因組G2配對(duì)capped-RNA leaders base pair with the G2 of RSV template RNA；B：帽子序列與RSV基因組U1配對(duì)capped-RNA leaders base pair with the U1 of RSV template RNA；C：帽子序列與RSV基因組G2U3配對(duì)capped-RNA leaders base pair with the G2U3 of RSV template RNA

3 討論

體外體系已被廣泛應(yīng)用于研究流感和一些布尼亞病毒的“抓帽”及與“抓帽”緊密伴隨的轉(zhuǎn)錄[18-26]。然而，這些研究都使用純度較高的病毒粒子，需要繁雜的預(yù)備實(shí)驗(yàn)。為獲得一種便捷的實(shí)驗(yàn)體系，本文研究了RSV粗提物的“抓帽”活性。

葉綠體是RSV粗提物中雜質(zhì)成分的重要來(lái)源（圖2）。根據(jù)條帶亮度判斷，葉綠體蛋白在粗提物總蛋白中的占比可能超過(guò)2/3。推測(cè)其原因是葉綠體在離心過(guò)程中與RSV病毒粒子發(fā)生了共沉淀。雖然它們?cè)诤罄m(xù)過(guò)程中被破壞，但本研究未以密度梯度離心將它們釋放出的蛋白與RSV進(jìn)行分離。按照這種推測(cè)，RSV粗提物中應(yīng)該還含有來(lái)源于線粒體及核糖體等細(xì)胞器或大分子的蛋白，只是相較于葉綠體蛋白來(lái)講，這些蛋白的占比較低。

盡管含有大量雜質(zhì)，本研究結(jié)果表明RSV粗提物具有體外“抓帽”活性，且在切割和利用帽子序列的方式上，其表現(xiàn)與細(xì)胞內(nèi)的RSV沒(méi)有明顯差別。主要證據(jù)有以下兩點(diǎn)：（1）以RSV粗提物與RCL配制反應(yīng)體系，短時(shí)間的孵育后，可以檢測(cè)到含珠蛋白-mRNA帽子序列的RSV mRNA，而帽子類(lèi)似物可以降低這類(lèi)mRNA的合成（圖3），表明RSV能利用溶液中的mRNA作為帽子序列供體來(lái)合成自身mRNA，且同在體內(nèi)一樣，這一過(guò)程需要帽子結(jié)構(gòu)的識(shí)別；（2）對(duì)體外合成的mRNA進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，RSV粗提物在A或C處切割珠蛋白-mRNA，得到能與自身模板鏈3′端U或G配對(duì)的帽子序列。在以這些帽子序列進(jìn)行mRNA合成時(shí)，RSV頻繁使用引發(fā)與重配（圖4）。這些現(xiàn)象都完全符合之前通過(guò)體內(nèi)研究提出的模型。值得指出的是，雖然纖細(xì)病毒的體外轉(zhuǎn)錄活性已有報(bào)道[31-32]，但還未有研究者對(duì)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。從這方面講，本文是首次明確表明纖細(xì)病毒可在體外從外源mRNA“抓帽”。

布尼亞病毒和正黏病毒在“抓帽”后的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中普遍使用引發(fā)與重配機(jī)制[3,33]。筆者前期發(fā)現(xiàn)，RSV也使用引發(fā)與重配，而且RSV在轉(zhuǎn)錄vRNA時(shí)比在轉(zhuǎn)錄vcRNA時(shí)更頻繁使用該機(jī)制[16]。起初，筆者推測(cè)這可能是RSV與寄主互作的結(jié)果，或者反映了RSV vRNA和vcRNA在表達(dá)上的時(shí)空差異。但后來(lái)發(fā)現(xiàn)，這種現(xiàn)象在RSV建立侵染的極早期就已出現(xiàn)[34]。因而，推測(cè)RSV對(duì)引發(fā)與重配機(jī)制的差異化使用可能是其模板鏈的固有差異造成的，與其他因素?zé)o關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)RSV在體外合成（轉(zhuǎn)錄自vRNA）時(shí)也比合成（轉(zhuǎn)錄自vcRNA）時(shí)更頻繁使用引發(fā)與重配，這進(jìn)一步支持了第二種推測(cè)。

RSV可與多種雙生病毒共侵染本氏煙。在共侵染植株中，RSV大量從雙生病毒抓取帽子序列。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)獲得RSV mRNA的帽子序列后，將它們Map到雙生病毒基因組，可以得到一個(gè)精細(xì)的雙生病毒轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（transcriptional start site，TSS）圖譜?；诖耍緦?shí)驗(yàn)室提出“抓帽”可被利用于病毒甚至寄主植物TSS的鑒定[35]。然而，該方法有其明顯缺點(diǎn)，即需要病毒的共侵染。一方面，這在很多情況下是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的；另一方面，RSV有可能會(huì)影響雙生病毒TSS的選擇。RSV體外“抓帽”體系的建立為解決這一缺點(diǎn)提供了可能。因而，除解析“抓帽”和轉(zhuǎn)錄機(jī)制外，本實(shí)驗(yàn)建立的體系還有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

RSV粗提物能從外源mRNA“抓帽”，并利用抓取的帽子序列轉(zhuǎn)錄自身模板鏈。在切割外源mRNA和利用其帽子序列的方式上，粗提物的表現(xiàn)與細(xì)胞內(nèi)的RSV無(wú)明顯差別，因而，基于粗提物的體外體系可以用于解析RSV的“抓帽”機(jī)制，甚至研究該病毒“抓帽”之后的轉(zhuǎn)錄機(jī)制。

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AnCap-snatching System of Rice Stripe Tenuivirus Based on Crude Virion Preparations

LIN WenZhong, WU Ran, JIN Jing, QIU Ping, ZHANG Jie, WU ZuJian, DU ZhenGuo

(Plant virus research institute, Fujian Agriculture and Forestry University/State Key Laboratory of Ecological Pest Control for Fujian and Taiwan Crops, Fuzhou 350002)

【】Viruses of the orderand the familycleave host cellular mRNAs 10-20 nucleotides downstream of the cap structure and use the 5′ terminal cleavage product as a primer to initiate the transcription of their template RNAs. This process is called cap-snatching, the result of which is that all viral mRNAs contain a host-derived capped-RNA leader (CRL). Rice stripe tenuivirus (RSV) is a plant-infecting bunyavirus for which the mechanism of cap-snatching remains poorly characterized.【】The objective of this study is to establish a convenientsystem to dissect the cap-snatching mechanisms of RSV, this study is designed to test whether crude preparations of RSV snatch CRLs from exogenously supplied mRNAs.【】Crude preparations of RSV were obtained by PEG precipitation combined with differential centrifugation. The protein components of the preparations were analyzed by SDS-PAGE and mass spectrometry. After adding rabbit reticulocyte lysate (RCL) rich inmRNAs, the preparations were used to establish ancap-snatching reaction mix. Total RNA was extracted from the reaction mix at the end of the reaction. RSV mRNAs with CRLs obtained frommRNAs were detected using nested RT-PCR. The products of the nested RT-PCR were cloned, and the sequences were analyzed.【】Two mL of crude RSV preparations was obtained from 100 g of virus-infected rice. The preparations contain chloroplast proteins including ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in addition to RSV virions. A 20 μL reaction system containing 2 μL RSV crude preparations, 8 μL RCL, 4 mmol·L-1MgCl2, 2 mmol·L-1of each NTP and 0.8 U·μL-1RNase inhibitor was prepared and incubated at 30℃ for 1.5 h. Clearly discernable bands with expected sizes were obtained in the nested RT-PCR, indicating that RSV crude preparations can cleave-mRNAs and use their CRLs. After adding the cap analogue m7G (5′) ppp (5′) G, the brightness of the bands was decreased and the extent of the decrease correlated with the concentration of the cap analogue, indicating that cap binding is essential for the cleavage. PCR bands with expected sizes were recovered and sequenced after cloning. Sequence analysis revealed a scenario reminiscent of that seen: RSV cleaves-mRNAs after A or C to obtain CRLs capable of base-pairing with its template RNAs. In initiating transcription with these CRLs, RSV uses the prime-and-realign mechanism frequently and has a greater tendency to use this mechanism in synthesizing nucleoprotein gene () than in synthesizing non-capsid protein gene () mRNAs.【】The crude preparations of RSV can snatch CRLs from exogenously added mRNAs and use the CRLs to prime transcription in a way just like it does. Therefore, RSV crude preparations can be used to dissect the cap-snatching or the transcription of RSV.

rice stripe tenuivirus (RSV); cap-snatching;transcription

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.21.012

2020-06-15；

2020-07-13

國(guó)家自然科學(xué)基金（31672005，31870150）、福建省自然科學(xué)基金（2019J01656，2016J05071）

林文忠，E-mail：linwenzhong1991@qq.com。通信作者吳祖建，E-mail：wuzujian@126.com。通信作者杜振國(guó)，E-mail：duzhenguo1228@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）