洪曉綠 潘小平 徐沛演 黃小華

可溶性纖維介素蛋白2（soluble fibrinogen like protein 2，sFGL2）屬纖維蛋白原相關(guān)超家族，與纖維蛋白原β 鏈和γ 鏈同源，其基因定位于7q11.23，全長約7 kb，含2 個外顯子，1 個內(nèi)含子［1］。sFGL2 主要是由T 淋巴細(xì)胞分泌，作為免疫抑制因子，它可抑制T 淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞活性，介導(dǎo)B 淋巴細(xì)胞凋亡［2］。國內(nèi)外已有研究表明，sFGL2 與胰腺炎［3］、冠心?。?］、腎細(xì)胞癌［5］等疾病相關(guān)。近年來，sFGL2在病毒性肝炎發(fā)病機制中的作用越來越受到重視，但大多研究主要以病理組織為主［6-7］，鑒于此，本文將分析sFGL2 表達(dá)變化及臨床意義，并與臨床相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在探討其預(yù)測CHB 患者臨床轉(zhuǎn)歸和預(yù)后的價值；同時深入研究sFGL2 在CHB 患者抗病毒治療前后表達(dá)變化，分析它成為CHB 患者抗病毒治療監(jiān)測指標(biāo)的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2019年8月1日～2020年1月22日在本院就診的CHB 患者140 例作為乙型肝炎病毒感染觀察組（CHB 組），男性86 例，女性54 例，平均年齡（38.96±12.07）歲。其中25 例CHB 患者依據(jù)臨床診斷需進(jìn)行抗病毒治療（抗病毒治療組），男性16 例，女性9 例，平均年齡（40.65±13.41）。選取同期丙型肝炎患者42 例作為丙型肝炎病毒感染觀察組（CHC 組），男性35 例，女性7 例，平均年齡（40.95±6.24）歲。另外選取同期體檢健康人群68例作為對照組，男性26 例，女性42 例，平均年齡（36.71±12.85）。各組間年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.492，P=0.116），具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)分別符合中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)會分會和中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會制定的慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）［8］或慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）［9］的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①乙肝及丙肝重疊感染者；②合并其他慢性肝病者；③合并肝惡性腫瘤或其他臟器惡性腫瘤者；④其他重要臟器功能不全。健康體檢志愿者未攜帶肝炎病毒?；颊邊⑴c前均簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理

所有受試者清晨空腹采集靜脈血5 mL 置于乙二胺四乙酸二鈉抗凝管中，抗病毒治療患者于抗病毒治療3 個月后清晨空腹另采集靜脈血5 mL置于乙二胺四乙酸二鈉抗凝管中。采血后30 min內(nèi)取全血1.5 mL 置于離心管中，按照人外周血淋巴細(xì)胞分離液（碧云天生物技術(shù)，上海）說明書，提取并純化外周血單個核細(xì)胞，-80℃保存；剩余全血1 500 rpm 離心20 min，分離血漿，-80℃保存。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血漿sFGL2 濃度

按照人可溶性纖維介素蛋白2（sFGL2）試劑盒（科易達(dá)生物科技有限公司，廣州）說明書檢測所有受試者血漿中sFGL2 濃度，CHB 組血漿同時送本院醫(yī)學(xué)檢驗科檢測HBV-DNA、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transferase，GGT）、總膽紅素（total bilirubin，T-Bil）和甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）。

1.2.3 實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測sFGL2mRNA 表達(dá)

Trizol（Invitrogen，美國）提取外周血單個核細(xì)胞總RNA 后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，用特異性引物（sFGL2-F：AGGCAGAAACGGACTGTTGT，sFGL2-R：CCAGGCGACCATGAAGTACA）進(jìn)行擴增，以GAPGH（GAPGH-F：TGCACCACCAACTGCTTAGC，GAPGH-R：GGCATGGACTGTGGTCATGAG）為內(nèi)參。體系如下：SYBRTMPremix 10 μL；Forward primer（10 pmol/μL）2 μL；Reverse primer（10 pmol/μL）2 μL；cDNA 3 μL；H2O 8 μL。95℃預(yù)變性2 min，然后按照以下條件執(zhí)行40 個循環(huán)：95℃10 s，60℃45 s。采用2-△△Ct法計算其相對表達(dá)量，其中△CT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，△△CT=△CT-△CT對照組最大值，每樣品重復(fù)3 次，取平均Ct 值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

運用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較F檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組間血漿sFGL2 濃度和sFGL2 mRNA 表達(dá)比較

3 組血漿sFGL2 濃度和sFGL2mRNA 表達(dá)水平比較：CHB 組＞CHC 組＞對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3 組間血漿sFGL2 和sFGL2 mRNA 表達(dá)量比較（±s）Table 1 Coparing the levels of plasma sFGL2 and sFGL2 mRNA in 3 groups（±s）

表1 3 組間血漿sFGL2 和sFGL2 mRNA 表達(dá)量比較（±s）Table 1 Coparing the levels of plasma sFGL2 and sFGL2 mRNA in 3 groups（±s）

組別CHB 組CHC 組對照組F 值P 值sFGL2 濃度（ng/mL）93.59±38.96 26.08±5.14 16.68±3.39 193.449＜0.001 sFGL2 mRNA 63.44±38.96 12.09±6.70 8.24±5.94 102.275＜0.001

2.2 血漿sFGL2 和sFGL2 mRNA 表達(dá)與CHB 患者各臨床指標(biāo)間的相關(guān)性分析

Spearman 分析結(jié)果表明，sFGL2 與HBV-DNA病毒載量、ALT、AST 呈正相關(guān)（P＜0.05），與GGT、T-Bil、AFP 無相關(guān)（P＞0.05），見表2。

表2 血漿sFGL2 和sFGL2 mRNA 表達(dá)與CHB 患者各臨床指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 2 analysising the correlation between plasma sFGL2 and sFGL2 mRNA expression with clinical indexes in CHB patients

2.3 抗病毒治療前后血漿sFGL2 濃度和sFGL2 mRNA 表達(dá)比較

抗病毒治療組經(jīng)3 個月抗病毒治療后血漿sFGL2 濃度和sFGL2mRNA 表達(dá)較抗病毒治療前顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

3 討論

目前，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）造成患者慢性感染的免疫學(xué)損傷機制仍不明確，T 淋巴細(xì)胞尤其是調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）在其發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起關(guān)鍵作用［10］。sFGL2 主要由T 淋巴細(xì)胞分泌，是Treg 細(xì)胞活性功能不可缺少的重要調(diào)節(jié)因子，其生物學(xué)功能已成為近年來研究的熱點［11］，與肝臟相關(guān)疾病的研究也涉及其中，如COLAK 等［12］報道sFGL2 在非酒精性脂肪肝病患者中高表達(dá)；AI 等［13］報道sFGL2在自身免疫性肝炎患者活動期顯著升高，其升高程度與AIH 嚴(yán)重程度成正比；YU 等［14］報道在暴發(fā)性肝炎中sFGL2 可激活補體系統(tǒng)，參與疾病的發(fā)展進(jìn)程。

sFGL2 在病毒相關(guān)持續(xù)感染過程中亦具有十分重要的作用。體外實驗表明，重組的sFGL2 可通過抑制Tregs 細(xì)胞，使Th1/Th2 淋巴細(xì)胞失衡［15］。體內(nèi)研究中，F(xiàn)oerster 等［16］證實在慢性丙型肝炎外周血中sFGL2 水平與疾病的分期和預(yù)后密切相關(guān)，肝臟炎性反應(yīng)和纖維化程度越嚴(yán)重，外周血sFGL2 水平越高。而本研究結(jié)果提示sFGL2 與病毒性肝炎密切相關(guān)。有研究指出sFGL2 是活化型肝臟星狀細(xì)胞的效應(yīng)分子，參與調(diào)控HBV 相關(guān)肝癌患者的T 淋巴細(xì)胞功能，而T 淋巴細(xì)胞失衡及免疫耐受是導(dǎo)致HBV 感染后慢性化成為CHB的關(guān)鍵性因素之一［17］。綜上推測，sFGL2 可能抑制了機體針對于HBV 的T 淋巴細(xì)胞活性，導(dǎo)致機體產(chǎn)生免疫耐受，從而促進(jìn)HBV 的復(fù)制和肝病的進(jìn)一步發(fā)展。因此，sFGL2 在CHB 中的發(fā)生發(fā)展以及臨床分期中的作用值得深入探討。

陳云茹等［18］研究血漿sFGL2 在HBV-DNA 不同病毒載量間無相關(guān)性，sFGL2 水平與CHB 患者肝功能密切相關(guān)。這些結(jié)果表明，sFGL2 參與了肝細(xì)胞炎癥壞死過程，從而影響肝臟合成功能。因此，sFGL2 水平有可能成為評估CHB 患者疾病嚴(yán)重程度的預(yù)測因子，它可作為CHB 診治、病情變化、臨床轉(zhuǎn)歸的觀察指標(biāo)，宜在臨床工作中開展檢測。

表3 抗病毒治療前后血漿sFGL2 和sFGL2 mRNA 表達(dá)量比較（±s）Table 3 Coparing the levels of plasma sFGL2 and sFGL2 mRNA befor and after antiviral treatment in 25 CHB cases（±s）

表3 抗病毒治療前后血漿sFGL2 和sFGL2 mRNA 表達(dá)量比較（±s）Table 3 Coparing the levels of plasma sFGL2 and sFGL2 mRNA befor and after antiviral treatment in 25 CHB cases（±s）

觀察指標(biāo)血漿sFGL2 濃度sFGL2 mRNA 相對表達(dá)量n 25 25抗病毒治療前127.41±24.07 97.26±12.38抗病毒治療后74.40±22.97 25.72±12.52 t 值48.463 22.068 P 值＜0.001＜0.001

本研究中CHB 患者經(jīng)抗病毒治療3月后，sFGL2 也顯著下降，這與吳盛迪等［19］研究結(jié)果一致，提示sFGL2 表達(dá)水平與抗病毒治療療效密切相關(guān)。因此，sFGL2 可成為CHB 患者抗病毒治療監(jiān)測指標(biāo)。然而本研究僅局限于sFGL2 在CHB患者外周血中的表達(dá)差異以及分析CHB 患者抗病毒前后該指標(biāo)的變化，未涉及其機制研究，下一步需進(jìn)行HBV 對sFGL2 基因的激活功能以及sFGL2抑制Tregs 細(xì)胞的相關(guān)機制研究。

綜上所述，sFGL2 作為一種免疫調(diào)節(jié)分子，在CHB 的病理生理過程中具有重要的免疫調(diào)控作用。它在CHB 患者外周血中高度表達(dá)，與肝損害臨床指標(biāo)密切相關(guān)，可作為CHB 診治、病情變化、臨床轉(zhuǎn)歸的觀察指標(biāo)。同時，sFGL2 在CHB 患者抗病毒治療后顯著性下降，它也可作為CHB 患者抗病毒治療療效的監(jiān)測指標(biāo)，宜在臨床工作中推廣應(yīng)用。