李巍 馮勝華 趙景明

骨關(guān)節(jié)炎是臨床常見的一種疾病，軟骨細(xì)胞凋亡率升高是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的重要原因［1-3］。miR-22-3p 在氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-22-3p 表達(dá)可保護(hù)ox-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷［4］。通過生物學(xué)信息分析顯示TRIM8 可能是miR-22-3p 的靶基因，TRIM8 在缺血再灌注腦損傷中上調(diào)表達(dá)，沉默其表達(dá)可減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的腦損傷［5］。但miR-22-3p 是否可靶向TRIM8 從而影響軟骨細(xì)胞損傷尚未可知。既往研究顯示IL-1β 屬于促炎因子并可促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展［6］。因此，本研究采用IL-1β 處理軟骨細(xì)胞構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎模型，觀察miR-22-3p 與TRIM8 的表達(dá)變化，探討miR-22-3p 對IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9 只SD 大鼠，SPF 級，購自南京君科生物工程有限公司，動物許可證號SCXK（寧）：2016-0003。IL-1β 購自美國Sigma 公司；miR-22-3p mimics、miR-NC、si-TRIM8、si-NC、anti-miR-22-3p、anti-miRNC 購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；pcDNA3.1購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；IL-6、IFN-γ、TNF-α ELISA 檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Lipofectamine2000 購自美國Invitrogen公司；Trizol 試劑購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購自北京博爾邁生物技術(shù)有限公司；熒光素酶報告基因載體購自南京中洪博元生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega 公司；兔抗鼠TRIM8 抗體購自美國Abcam 公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax 抗體購自美國CST 公司；RIPA 裂解液與BCA蛋白定量檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及實驗分組

軟骨細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法［7-8］。同時將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為Con 組。分別將miR-NC、miR-22-3p mimics、si-NC、si-TRIM8、miR-22-3p mimics 與pcDNA、miR-22-3p mimics 與pcDNA-TRIM8 轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞，加入濃度為10 ng/mL IL-1β 處理48 h，分別記作IL-1β+miR-NC 組、IL-1β+miR-22-3p 組、IL-1β+si-NC 組、IL-1β+si-TRIM8 組、IL-1β+miR-22-3p+pcDNA 組、IL-1β+miR-22-3p+pcDNATRIM8 組。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測miR-22-3p、TRIM8 mRNA 的表達(dá)水平

采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定RNA 濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR 反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，Real-Time Master Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：95℃2 min，95℃15 s，60℃1 min，72℃30 s（循環(huán)40 次）。miR-22-3p 以U6 為內(nèi)參，TRIM8 以GAPDH 為 內(nèi) 參，采 用2-ΔΔCt法 計 算miR-22-3p、TRIM8 mRNA 的表達(dá)水平。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測IL-6、IFN-γ、TNF-α 含量

收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，檢測IL-6、IFN-γ、TNF-α 水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

收集各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS 清洗，4℃條件下經(jīng)1 000 r/min 離心10 min，加入500 μL Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，依次加入5 μL Annexin V-FITC，充分混勻，加入5 μL PI，充分混勻，室溫避光孵育10 min，利用流式細(xì)胞儀檢測各組軟骨細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測miR-22-3p 的靶基因

StarBase 預(yù)測顯示miR-22-3p 與miR-149-5p 存在靶向關(guān)系，構(gòu)建野生型載體WT-TRIM8、突變型載體MUT-TRIM8，取對數(shù)生長期軟骨細(xì)胞，分別將miR-NC、miR-22-3p mimics 與WT-TRIM8、MUTTRIM8 共轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞，檢測各組熒光素酶活性。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測TRIM8、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，加入RIPA 蛋白裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，檢測蛋白濃度，SDS-PAGE 分離蛋白，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)膜、封閉，加入TRIM8（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）一抗稀釋液，4℃孵育過夜，TBST 洗滌，加入二抗稀釋液（1∶2 000），暗室內(nèi)曝光顯影，置于自動凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料均符合正態(tài)分布，以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-22-3p 和TRIM8 在IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷中的表達(dá)

與Con 組比較，IL-1β 組細(xì)胞中miR-22-3p 的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），TRIM8 mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 miR-22-3p 和TRIM8 在IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷中的表達(dá)（±s）Table 1 Expression of miR-22-3p and TRIM8 in IL-1β-induced chondrocyte injury（±s）

表1 miR-22-3p 和TRIM8 在IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷中的表達(dá)（±s）Table 1 Expression of miR-22-3p and TRIM8 in IL-1β-induced chondrocyte injury（±s）

分組Con IL-1β t 值P 值n99 miR-22-3p 1.00±0.06 0.41±0.05 22.663 0.000 TRIM8 mRNA 0.99±0.05 3.11±0.29 21.612 0.000 TRIM8 蛋白0.39±0.04 0.78±0.07 14.512 0.000

2.2 miR-22-3p 過表達(dá)對IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷的影響

與Con組比較，IL-1β組細(xì)胞IL-6、IFN-γ、TNF-α水平、細(xì)胞凋亡率及Bax 蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與IL-1β+miR-NC 組比較，IL-1β+miR-22-3p 組細(xì)胞IL-6、IFN-γ、TNF-α水平、Bax 蛋白水平、細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 抑制TRIM8 表達(dá)對IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷的影響

與IL-1β+si-NC 組比較，IL-1β+si-TRIM8 組細(xì)胞IL-6、IFN-γ、TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），Bax 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見表3。

表2 miR-22-3p 過表達(dá)對IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷的影響（±s）Table 2 The effect of miR-22-3p overexpression on chondrocyte injury induced by IL-1β（±s）

表2 miR-22-3p 過表達(dá)對IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷的影響（±s）Table 2 The effect of miR-22-3p overexpression on chondrocyte injury induced by IL-1β（±s）

注：與Con 組比較，aP＜0.05；與IL-1β+miR-NC 組比較，bP＜0.05。

分組Con IL-1β IL-1β+miR-NC IL-1β+miR-22-3p F 值P 值n9999 miR-22-3p 1.01±0.06 0.46±0.04a 0.44±0.04 0.82±0.08b 213.159 0.000 IL-6（ng/L）2.45±0.25 7.55±0.71a 7.61±0.72 3.56±0.35b 214.146 0.000 IFN-γ（ng/L）11.54±1.12 62.33±6.14a 64.28±6.32 17.25±1.54b 355.917 0.000 TNF-α（ng/L）7.22±0.71 31.65±3.11a 33.27±3.35 10.87±1.01b 297.734 0.000凋亡率（%）6.32±0.61 24.13±2.11a 25.36±2.32 11.25±1.14b 279.116 0.000 Bcl-2 蛋白0.73±0.07 0.30±0.03a 0.28±0.03 0.64±0.05b 209.054 0.000 Bax 蛋白0.22±0.03 0.63±0.06a 0.65±0.05 0.33±0.03b 211.861 0.000

表3 抑制TRIM8 表達(dá)對IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷的影響（±s）Table 3 The effect of inhibiting TRIM8 expression on IL-1β-induced chondrocyte injury（±s）

表3 抑制TRIM8 表達(dá)對IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷的影響（±s）Table 3 The effect of inhibiting TRIM8 expression on IL-1β-induced chondrocyte injury（±s）

注：與Con 組比較，aP＜0.05；與IL-1β+si-NC 組比較，bP＜0.05。

分組Con IL-1β IL-1β+si-NC IL-1β+si-TRIM8 F 值P 值n9999 TRIM8 蛋白0.36±0.03 0.77±0.07a 0.79±0.08 0.43±0.04b 131.196 0.000 IL-6（ng/L）2.67±0.26 7.84±0.77a 7.91±0.76 3.86±0.38b 190.634 0.000 IFN-γ（ng/L）10.32±1.04 61.39±6.11a 63.54±6.21 24.15±2.44b 220.852 0.000 TNF-α（ng/L）7.01±0.69 32.45±3.22a 34.67±3.41 15.28±1.52b 261.030 0.000凋亡率（%）7.36±0.71 23.66±2.31a 24.87±2.43 13.58±1.36b 185.700 0.000 Bcl-2 蛋白0.72±0.06 0.31±0.03a 0.30±0.03 0.59±0.05b 198.987 0.000 Bax 蛋白0.21±0.03 0.62±0.06a 0.63±0.06 0.39±0.04b 150.773 0.000

2.4 miR-22-3p 靶向調(diào)控TRIM8 的表達(dá)

StarBase 預(yù)測顯示TRIM8 的3′UTR 中含有與miR-22-3p 互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖1。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型載體WTTRIM8 的細(xì)胞實驗中，與miR-NC 組比較，miR-22-3p 組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-TRIM8 的細(xì)胞實驗中，miR-22-3p組熒光素酶活性與miR-NC 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。與miR-NC 組比較，miR-22-3p 組細(xì)胞中TRIM8 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與anti-miR-NC 組比較，anti-miR-22-3p 組細(xì)胞中TRIM8 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。見表5。

表4 雙熒光素酶報告實驗檢測miR-22-3p 與TRIM8 的靶向關(guān)系（±s）Table 4 Dual-luciferase reporting assay was used to detect the targeted relationship between Mir-22-3p and TRIM8（±s）

表4 雙熒光素酶報告實驗檢測miR-22-3p 與TRIM8 的靶向關(guān)系（±s）Table 4 Dual-luciferase reporting assay was used to detect the targeted relationship between Mir-22-3p and TRIM8（±s）

注：與miR-NC 組比較，aP＜0.05。

分組miR-NC miR-22-3p t 值P 值n99 WT-TRIM8 1.02±0.06 0.48±0.04a 22.465 0.000 MUT-TRIM8 0.99±0.05 1.00±0.05 0.424 0.677

2.5 TRIM8 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-22-3p 過表達(dá)對IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷的作用

與IL-1β+miR-22-3p+pcDNA 組比較，IL-1β+miR-22-3p+pcDNA-TRIM8 組細(xì)胞IL-6、IFN-γ、TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），Bax 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。見表6。

表5 敲除或過表達(dá)miR-22-3p 對TRIM8 蛋白表達(dá)的影響（±s）Table 5 Effect of knockout or overexpression of miR-22-3p on TRIM8 protein expression（±s）

表5 敲除或過表達(dá)miR-22-3p 對TRIM8 蛋白表達(dá)的影響（±s）Table 5 Effect of knockout or overexpression of miR-22-3p on TRIM8 protein expression（±s）

注：與miR-NC 組比較，aP＜0.05；與anti-miR-NC 組比較，bP＜0.05。

分組miR-NC miR-22-3p anti-miR-NC anti-miR-22-3p F 值P 值n9999 TRIM8 蛋白0.41±0.04 0.20±0.02a 0.38±0.03 0.83±0.07b 328.154 0.000

3 討論

miR-22-3p 在視網(wǎng)膜病變中表達(dá)降低，抑制視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷［9］。miR-22-3p 過表達(dá)可減輕阿爾茨海默癥細(xì)胞模型損傷［10］。miR-22-3p 可減輕牙周膜干細(xì)胞炎癥反應(yīng)并可調(diào)控細(xì)胞分化［11］。本研究結(jié)果提示miR-22-3p 表達(dá)量降低可能促進(jìn)細(xì)胞損傷的發(fā)生。為探究miR-22-3p 在軟骨細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制，已有報道指出IL-6、IFN-γ、TNF-α 水平升高可加重炎癥反應(yīng)從而促進(jìn)多種疾病發(fā)生［12］。本研究結(jié)果提示miR-22-3p 過表達(dá)可減輕IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥損傷。同時本研究結(jié)果顯示IL-1β 處理后軟骨細(xì)胞凋亡率顯著增加，而miR-22-3p 過表達(dá)后軟骨細(xì)胞凋亡率顯著降低，提示miR-22-3p 過表達(dá)可抑制IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步驗證其可能調(diào)控機(jī)制，本研究檢測抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2 和促細(xì)胞凋亡蛋白Bax 的表達(dá)。已有研究表明當(dāng)細(xì)胞接收凋亡信號時，Bcl-2 表達(dá)下調(diào)，Bax 表達(dá)上調(diào)，并可激活caspase 聯(lián)級反應(yīng)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］。本研究結(jié)果顯示IL-1β 處理后軟骨細(xì)胞中Bcl-2 表達(dá)下調(diào)，Bax 表達(dá)上調(diào)，而miR-22-3p 過表達(dá)后軟骨細(xì)胞中Bcl-2 表達(dá)上調(diào)，Bax 表達(dá)下調(diào)，提示miR-22-3p過表達(dá)可能通過調(diào)控Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)從而抑制軟骨細(xì)胞凋亡。

表6 TRIM8 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-22-3p 過表達(dá)對IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷的作用（±s）Table 6 TRIM8 overexpression reverses the effect of miR-22-3p overexpression on IL-1β-induced chondrocyte injury（±s）

表6 TRIM8 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-22-3p 過表達(dá)對IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷的作用（±s）Table 6 TRIM8 overexpression reverses the effect of miR-22-3p overexpression on IL-1β-induced chondrocyte injury（±s）

注：與IL-1β+miR-NC 組比較，aP＜0.05；與IL-1β+miR-22-3p+pcDNA 組比較，bP＜0.05。

分組IL-1β+miR-NC IL-1β+miR-22-3p IL-1β+miR-22-3p+pcDNA IL-1β+miR-22-3p+pcDNA-TRIM8 F 值P 值n9999 TRIM8 蛋白0.76±0.07 0.33±0.03a 0.32±0.03 0.65±0.06b 175.340 0.000 IL-6（ng/L）7.71±0.69 3.42±0.34a 3.40±0.33 7.12±0.71b 161.510 0.000 IFN-γ（ng/L）63.54±6.33 16.47±1.65a 16.24±1.62 52.13±5.21b 295.322 0.000 TNF-α（ng/L）32.48±3.22 11.25±1.13a 10.52±1.06 26.33±2.61b 234.315 0.000凋亡率（%）26.14±2.63 12.36±1.23a 11.47±1.15 20.33±2.13b 122.120 0.000 Bcl-2 蛋白0.29±0.03 0.66±0.05a 0.67±0.04 0.41±0.04b 193.591 0.000 Bax 蛋白0.64±0.06 0.31±0.03a 0.29±0.03 0.53±0.05b 132.873 0.000

TRIM8 在OGD/R 誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞損傷中表達(dá)上調(diào)，敲低其表達(dá)可升高OGD/R 誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞活性，降低細(xì)胞凋亡，減少ROS 的產(chǎn)生［14］。TRIM8 在肝缺血再灌注損傷小鼠模型中高表達(dá)，沉默其表達(dá)可抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的肝炎癥損傷和細(xì)胞凋亡［15］。本研究結(jié)果顯示IL-1β 處理后軟骨細(xì)胞中TRIM8 的表達(dá)量顯著升高，進(jìn)一步研究顯示抑制TRIM8 表達(dá)后可顯著降低IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中IL-6、IFN-γ、TNF-α 的水平，并可降低軟骨細(xì)胞凋亡率，還可促進(jìn)Bcl-2 表達(dá)及抑制Bax 表達(dá)，提示抑制TRIM8 表達(dá)可減輕IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷。本研究通過雙熒光素酶報告實驗與Western blot 實驗證實miR-22-3p 可靶向結(jié)合TRIM8，并可負(fù)向調(diào)控TRIM8 的表達(dá)及活性，為探究miR-22-3p 是否可通過靶向TRIM8 從而參與軟骨細(xì)胞損傷過程，本研究將pcDNA-TRIM8 與miR-22-3p mimics 共轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞，隨后使用IL-1β 處理，結(jié)果顯示IL-6、IFN-γ、TNF-α 水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bcl-2 蛋白水平顯著降低，Bax 蛋白水平顯著升高，提示miR-22-3p 過表達(dá)可能通過下調(diào)TRIM8 表達(dá)而降低炎癥反應(yīng)及抑制軟骨細(xì)胞凋亡。

綜上所述，IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中miR-22-3p的表達(dá)下調(diào)，TRIM8 的表達(dá)上調(diào)，miR-22-3p 過表達(dá)可能通過調(diào)控TRIM8 表達(dá)從而減輕IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥損傷，并可抑制軟骨細(xì)胞凋亡，可為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供理論依據(jù)。