周曉光 王浩舟 李彥生

[摘要] 目的 建立更加快速便捷的腎臟腫瘤及正常腎小管上皮細胞原代培養(yǎng)方法。 方法 選取2019年1—3月首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院行腎癌根治性切除術和腎部分切除術后患者新鮮的腎透明細胞癌組織和腎臟皮質(zhì)組織。采用機械分解，膠原酶消化和細胞連續(xù)篩分提純的方法提純腫瘤和正常原代細胞。分別通過轉錄組測序（RNA-seq）技術鑒定兩種原代細胞的遺傳背景，免疫細胞化學鑒定細胞標志物的表達，透射電鏡觀察原代細胞的超微結構。最后采用裸鼠荷瘤模型鑒定腫瘤細胞的成瘤特性。 結果 共計分離純化3株人近端腎小管上皮原代細胞，8株腎透明細胞癌原代細胞。RNA-seq顯示測序結果符合兩類細胞的遺傳學背景，免疫細胞化學可鑒定出近端腎小管上皮細胞標志蛋白的表達。透射電鏡可觀察到兩類細胞特異性超微結構。裸鼠荷瘤模型證實了腎癌原代細胞的成瘤特性。 結論 成功建立并確定一種快速便捷的腎癌細胞和腎小管上皮細胞原代培養(yǎng)的流程和方法。

[關鍵詞] 原代細胞培養(yǎng);腎細胞癌;近端腎小管上皮細胞;轉錄組測序

[中圖分類號] R737.11 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）09（b）-0004-05

[Abstract] Objective To establish a more rapid and convenient method for primary culture of renal tumor and normal renal tubular epithelial cells. Methods Fresh clear renal cell carcinoma tissue and renal cortical tissue from patients undergoing radical nephrectomy and partial nephrectomy in Beijing Chaoyang Hospital， Capital Medical University from January to March 2019 were selected. The tumor and normal primary cells were purified by mechanical segmentation， collagenase digestion and continuous cell screening and purification. The genetic background of the two primary cells was identified by transcriptomic sequencing （RNA-seq） technique， the expression of cell markers was identified by immunocytochemistry， and the ultrastructure of the primary cells was observed by transmission electron microscopy. Finally， the tumorigenesis characteristics of tumor cells were identified by the model of nude mice bearing tumors. Results A total of three human proximal tubular epithelial primary cells and eight renal clear cell carcinoma primary cells were isolated and purified. RNA-seq showed that the sequencing results were consistent with the genetic background of the two types of cells， and immunocytochemistry could identify the expression of marker proteins in the proximal renal tubular epithelial cells. Two kinds of cell specific ultrastructure could be observed by transmission electron microscope. The tumor bearing model of nude mice confirmed the tumorigenic properties of primary renal cell carcinoma cells. Conclusion A rapid and convenient processes and methods for primary culture of renal carcinoma cells and renal tubular epithelial cells is successfully established.

[Key words] Primary cells culture; Renal cell carcinoma; Human proximal tubular epithelial cells; Transcriptomic sequencing

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是泌尿生殖系統(tǒng)第二大腫瘤。進展期腎癌的治療主要集中在靶向治療和免疫治療兩個方面，治療方法有限[1]。尋求更加有效的腎癌治療方法是臨床和科研工作者面臨的一個重大挑戰(zhàn)。精準治療在RCC的治療過程中越來越受到重視。由于RCC腫瘤異質(zhì)性的存在[2]，商業(yè)化的腎癌細胞系雖可用作開發(fā)新的治療方法的疾病模型，但在基因組和轉錄水平上并不能準確地反映原發(fā)腎癌的遺傳特性。RCC的主要細胞亞型為腎透明細胞癌（ccRCC）。全基因組分析顯示ccRCC細胞系的基因拷貝數(shù)改變和ccRCC組織存在較大差異[3]。又有研究發(fā)現(xiàn)兩者的基因轉錄普差異更為顯著[4]。越來越多的文獻報道了原代細胞培養(yǎng)在腫瘤研究中的重要性[5-7]。更為重要的是，由于缺乏與腫瘤細胞相匹配的正常對照細胞，進一步限制了抗腫瘤藥物篩選、藥理毒性研究等科研工作的開展。本研究描述了一種快速便捷的人腎癌細胞（human renal tumour cells，HRTC）和人近端腎小管上皮細胞（human proximal tubular epithelial cells，HPTEC）原代培養(yǎng)的標準化流程和方法，并用轉錄組測序（RNA-seq）的方法對培養(yǎng)物的遺傳學背景加以確認。為RCC個性化藥物治療方法的發(fā)展提供了重要實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

原代HRTC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的IMDM（Gibco，12440053）培養(yǎng)基中。原代HPTEC培養(yǎng)于腎臟上皮細胞生長專用培養(yǎng)基（PromoCell，c-26030）中。細胞培養(yǎng)用青霉素/鏈霉素溶液，0.05%胰蛋白酶EDTA溶液，不含CaCl2和MgCl2的HBSS緩沖液均購自于Gibco，Ⅱ型膠原酶購自于worthington（LS004176-1GM）。堿性磷酸酶試劑盒購自于南京建成生物工程研究所（D001-1-1）。Pan-Cytokeratin（CK）抗體（ZM-0069）、α-SMA抗體（ZM-0003）、Vimentin抗體（ZM-0260）、PAX8抗體（ZM-0468）和S-P偶聯(lián)免疫組織化學試劑盒（SP-9000）購自于北京中山金橋生物技術有限公司。100、70、40 μm細胞篩購自于BD FalconTM。

1.2 HRTC和HPTEC的分離、培養(yǎng)、凍存

1.2.1 HRTC和HPTEC的分離 ?選取首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院（以下簡稱“我院”）行腎癌根治性切除術和腎部分切除術后的手術標本，共8例，男5例，女3例?；颊咂骄挲g（58±6）歲，每份組織切取量約10 g。切取腎透明細胞癌組織和遠離腫瘤的正常腎臟皮質(zhì)組織。切取組織均通過病理學評估。將組織浸入無菌IMEM細胞培養(yǎng)基中并置于冰上，30 min內(nèi)轉移至實驗室開始細胞提取工作：①粉碎組織，組織盛放無菌細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，頭戴式放大鏡下顯微操作。切除腫瘤組織內(nèi)血管筋膜等結締組織，保留黃色腫瘤組織。腎皮質(zhì)組織剔除腎周纖維囊。無菌眼科剪刀將組織切割為直徑約1 mm組織塊。②充分清洗，收集粉碎組織于15 mL離心管中，預冷無菌HBSS沖洗3遍。1000 r/min（離心半徑167 mm）離心10 min。③膠原酶消化，溶解100 mg Ⅱ型膠原酶（280 U/mg）于50 mL IMEM培養(yǎng)基中，0.22 μm無菌濾膜過濾后備用。分別將10 mg腫瘤組織和正常腎組織置入25 mL膠原酶溶液中，置于37℃恒溫搖床中，連續(xù)震蕩1～2 h。配合吸管間斷吹打增加組織裂解效果。④原代細胞連續(xù)篩分，膠原酶消化后的組織液離心后棄上清。預冷無菌HBSS反復沖洗3遍。再次預冷無菌HBSS重新懸浮細胞后，依次用100、70、40 μm細胞篩過濾。

1.2.2 HRTC和HPTEC的培養(yǎng)、凍存 ?過濾后的細胞懸液離心棄上清液后生理鹽水懸浮細胞。取20 μL細胞懸液加20 μL胎盤藍混勻后記數(shù)。細胞計數(shù)后調(diào)整細胞接種濃度為5×104/cm2。細胞充分吹打混勻后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。置孵育箱（37℃，5%CO2）培養(yǎng)。24 h后全量更換培養(yǎng)液，以后每3 d換液1次。細胞融合度80%左右時細胞傳代培養(yǎng)或凍存。按照上述方法，HRTC細胞在接種后7～10 d達到傳代和凍存條件。HPTEC細胞生長速度較快，則需要3～5 d。將第2～3代原代細胞進行凍存，以控制傳代間的變異性。

1.3 原代細胞RNA-seq

Trizol法提取HPTEC和HRTC RNA。原代細胞的illumina RNA-seq工作交于北京博奧晶典生物技術有限公司完成，具體方法同文獻[8]。

1.4 免疫細胞化學檢測

HPTEC或HRTC接種于24孔板。細胞融合度達50%時開始后續(xù)實驗。無菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3遍，4%甲醛固定20 min，1%Triton X-100溶液破膜5 min。之后細胞用1%牛血清白蛋白、0.4%Triton X-100和4%疊氮鈉混合物4℃封閉過夜。之后依次加入小鼠抗人一抗[pan-CK抗體（1∶100）α-SMA抗體（1∶100）、Vimentin抗體（1∶100）、PAX8抗體（1∶100）]及山羊抗鼠二抗（1∶100）室溫下分別孵育2 h。PBS沖洗3遍后，按照S-P偶聯(lián)免疫組織化學試劑盒說明書完成后續(xù)實驗。PBS作為一抗陰性對照。中性樹脂封片后顯微鏡下觀察。

1.5 透射電鏡細胞超微檢測

收集原代HPTEC和HRTC。3%戊二醛溶液固定，環(huán)氧樹脂包埋，制備超薄切片，在JEM-2100HR型透射電子顯微鏡（首都醫(yī)科大學中心實驗室提供）下觀察和鑒定HPTEC和HRTC超微細胞結構。

1.6 堿性磷酸酶染色

6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)置入無菌細胞爬片，然后接種HPTEC。細胞融合度達50%時開始后續(xù)實驗。堿性磷酸酶染色采用南京建成生物工程研究所堿性磷酸酶染色試劑盒。

1.7 裸鼠荷瘤模型建立

BALB/c（nu/nu）雌性裸鼠（由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供）飼養(yǎng)于我院醫(yī)學研究中心暨國家重點學科呼吸病學實驗SPF屏障系統(tǒng)動物室。鼠齡5～6周，體重18～20 g。實驗動物生產(chǎn)和使用許可證號：SYXK（京）2020-0005。實驗過程中嚴格遵循實驗動物倫理相關規(guī)定。選取2～3代原代HRTC，細胞懸浮于100 μL預冷的PBS和基質(zhì)膠（Matrigel）混懸溶液（PBS：Matrigel=1∶1）中。每次接種細胞量1.0×106個。接種于裸鼠左肋部建造腎癌裸鼠移植瘤模型。記錄成瘤時間，計算成瘤百分率，測量腫瘤長徑、短徑、重量，并進行病理學檢查。

2 結果

2.1 觀察原代細胞生長觀察

共計分離純化得到3株原代HPTEC及8株原代透明細胞型HRTC。所有組織樣本均完成病理確認。倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)瓶中的細胞生長。HPTEC形態(tài)呈典型的多邊鵝卵石樣，鏡下透明度及折光性強，各細胞緊密相靠，互相銜接，可見融合成片及復層生長。HPTEC生長速度較快，3～4 d細胞融合度可達80%～90%。HRTC呈多樣性，細胞形態(tài)大小不一。胞漿內(nèi)可見大量的脂肪顆粒（圖1）。生長速度相對較慢，傳代凍存間隔時間為5～6 d。在本實驗的條件下，HRTC傳代5次以后生長速度明顯變緩。HPTEC傳代10次左右時生長速度未見明顯變緩。連續(xù)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)過程中HRTC逐漸失去“透明細胞”表型，胞漿內(nèi)富含的脂肪顆粒隨傳代次數(shù)逐漸減少。

2.2 細胞轉錄組測序結果

3株HPTEC的基因表達譜如下圖所示（圖2A，封三）。測序結果提示HPTEC和HRTC均表達近端腎小管上皮的標志物，均未見明顯遠端腎小管上皮相關標志物表達（圖2B，封三）。分析HRTC與HPTEC的基因表達譜，兩種細胞差異基因的表達與文獻報道的腎癌和正常腎組織的差異基因的表達相符合（圖2C，封三）[9-11]。如在HRTC內(nèi)高表達的基因有：CA9、VEGFA、APLN、ALDH1A1、C4A、C4B、ENPP3、NDUFA4L2等。在HRTC內(nèi)低表達的基因有：VHL、PBRM1、MAL、SLIT2、GATA3、TFAP2B、TFCP2L1等（圖2C，封三）。

2.3 免疫細胞化學檢測與堿性磷酸酶檢測

所培養(yǎng)的HPTEC表達Pan-CK和PAX8蛋白，而沒有α-SMA和Vimentin的蛋白表達（圖3，封三）。堿性磷酸酶染色（偶氮偶聯(lián)法）中可見HPTEC和HRTC胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量棕紅色顆粒形成。提示原代細胞堿性磷酸酶含量豐富（圖4A～B，封三）。

2.4 透射電鏡細胞超微檢測

收集第2代HPTEC和HRTC送檢透射電鏡。透射電子顯微鏡下原代HPTEC可見典型的頂端微絨毛形成，胞漿內(nèi)可見大量線粒體形成（圖4C～D，封三）[12-13]。HRTC電鏡下胞質(zhì)內(nèi)充斥大量的脂滴，呈圓形卵圓形，沒有界膜，均電子密度。有少量線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體及其他細胞器（圖4E，封三）[14-15]。

2.5 HRTC裸鼠移植瘤模型建立

使用分離純化得到的4株原代HRTC進行裸鼠荷瘤模型建立。共接種裸鼠20只，荷瘤成功19只。皮下移植瘤模型的成瘤時間為5～7 d。皮下接種28 d后移植瘤平均長徑為（23.58±2.85）mm，平均短徑為（11.18±1.89）mm，平均體積為（1988.13±359.76）mm3，平均瘤重為（1.45±0.27）g（圖4A）。移植瘤HE染色顯示，瘤體由大量透明細胞組成，癌細胞體積大，呈圓形或多邊形，輪廓清楚，具有清晰的胞膜，豐富透明的胞漿。組織間質(zhì)內(nèi)可見大量微血管結構。經(jīng)兩名病理醫(yī)生確認符合腎透明細胞癌的組織特征（圖4B）。

3 討論

由于精準醫(yī)學發(fā)展的需要，腫瘤患者的個體化治療被越來越多的患者所接受[16]。商業(yè)化的腎癌細胞系雖可用作臨床前期研究的工具細胞，但由于遺傳背景與原發(fā)腎癌的明顯差異，使研究結果缺乏直接的臨床指導意義。因此把人源性原代細胞作為工具細胞深入研究，更加具有臨床指導意義[1，17-18]。建立一種實用的方法從臨床組織標本中分離原代腫瘤細胞和與之相匹配的原代正常細胞是很有必要的。

目前，永生化細胞系通常由病毒轉導產(chǎn)生。雖然永生化細胞系易于體外培養(yǎng)，但經(jīng)過長期培養(yǎng)和多次傳代，永生化HPTEC細胞株將逐漸失去上皮表型和特性。又由于腫瘤細胞遺傳學的不穩(wěn)定性，RCC細胞系遺傳學背景與臨床RCC組織存在較大差異。相比之下，原代細胞更能代表人體真實生理環(huán)境和遺傳學背景。目前人原代HPTEC和HRTC培養(yǎng)物建立的難點是如何建立純度高、數(shù)量足、重復性好的原代HPTEC和HRTC培養(yǎng)物。常用的原代細胞分離培養(yǎng)方法可分為兩類：組織塊貼壁法和膠原酶消化法。組織塊貼壁法培養(yǎng)原代HPTEC過程中常見的問題是成纖維細胞和遠端腎單位的污染[19-20]。另有研究試圖通過使用免疫磁珠技術或Percoll溶液密度梯度離心來促進HPTEC的富集，但細胞提純流程繁瑣并且細胞產(chǎn)量低和活力低[21-22]。本研究證實機械分解，膠原酶消化和細胞連續(xù)篩分的原代細胞分離方法操作簡單快捷。不僅增加了原代培養(yǎng)時細胞的獲得量，同時也避免了繁瑣的分離純化過程對細胞造成損傷，更大限度地保護了原代細胞的活性。本實驗的另一關鍵在于如何精確獲取細胞組織。顯微操作應用于分離目標組織，可以更大限度地去除雜質(zhì)組織，有利于后期細胞純化。本實驗的不足在于采用機械分離純化的方法，無法達到流式細胞分選的精度。但后期的RNA-seq結果卻證實了該方法所得細胞的純度較高?？赡苁且驗榉蛛x純化后數(shù)目較多的目標細胞成為“優(yōu)勢細胞”，在后續(xù)的培養(yǎng)過程中雜質(zhì)細胞失去了“細胞群體效應”而最終消亡。

Valente等[23]建立一種與本研究相類似的分離提純原代細胞的方法。然而，另一個研究采用同樣的方法提純HPTEC和HRTC[24]，卻得出令人困惑的結果。結果提示在基因測序過程中發(fā)現(xiàn)此法提純的原代腫瘤細胞中存在大量的正常細胞。為解決這一矛盾問題，本研究試圖通過嚴格優(yōu)化原代細胞提純步驟，首次通過RNA-seq的方法驗證原代細胞遺傳學背景。證實了機械分解，膠原酶消化和細胞連續(xù)篩分是一種快速便捷的原代細胞提純方法。所分離HPTEC和HRTC細胞純度高，符合文獻所報道的兩種細胞的遺傳學背景[9-11]。進一步連續(xù)倒置顯微鏡觀察還發(fā)現(xiàn)，隨傳代次數(shù)增多，HRTC逐漸失去“透明細胞”表型，胞漿內(nèi)富含的脂肪顆粒逐漸減少。具體細胞表型變化的分子機制還待后續(xù)進一步深入研究?？赡芘c體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)差異有關。因此，本研究使用第2～3代細胞進行后續(xù)研究，以控制傳代間的變異性。

為確保實驗的可重復性，本實驗對上述分離純化方法做了如下3點優(yōu)化：①嚴格剔除腫瘤組織內(nèi)壞死和血管等纖維結締組織，頭戴放大鏡下顯微操作;②膠原酶充分消化裂解組織，配合吸管間斷吹打增加組織裂解效果;③實驗需選取1～3代的HRTC作為工具細胞。綜上，本研究驗證了一種快速有效的原代HPTEC和HRTC分離提純方法，使為腎細胞癌個體化精準治療提供良好的細胞模型成為可能。

[參考文獻]

[1] ?Atkins MB，Tannir NM. Current and emerging therapies for first-line treatment of metastatic clear cell renal cell carcinoma [J]. Cancer Treat Rev，2018，70：127-137.

[2] ?Brugarolas J. Molecular genetics of clear-cell renal cell carcinoma [J]. J Clin Oncol，2014，32（18）：1968-1976.

[3] ?Beroukhim R，Brunet JP，Di Napoli A，et al. Patterns of gene expression and copy-number alterations in von-hippel lindau disease-associated and sporadic clear cell carcinoma of the kidney [J]. Cancer Res，2009，69（11）：4674-4681.

[4] ?Lee J，Kotliarova S，Kotliarov Y，et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines [J]. Cancer Cell，2006，9（5）：391-403.

[5] ?van Staveren WC，Solís DY，Hébrant A，et al. Human cancer cell lines：Experimental models for cancer cells in situ？ For cancer stem cells？ [J]. Biochim Biophys Acta，2009，1795（2）：92-103.

[6] ?Pollard SM，Yoshikawa K，Clarke ID，et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens [J]. Cell Stem Cell，2009，4（6）：568-580.

[7] ?van de Wetering M，F(xiàn)rancies HE，F(xiàn)rancis JM，et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients [J]. Cell，2015，161（4）：933-945.

[8] ?Li XN，Wang ZJ，Ye CX，et al. Circular RNA circVAPA is up-regulated and exerts oncogenic properties by sponging miR-101 in colorectal cancer [J]. Biomed Pharmacother，2019（112）：108611.

[9] ?Wang M，Li X，Zhang J，et al. AHNAK2 is a Novel Prognostic Marker and Oncogenic Protein for Clear Cell Renal Cell Carcinoma [J]. Theranostics，2017，7（5）：1100-1113.

[10] ?Xu S，Zhang H，Chong Y，et al. YAP Promotes VEGFA Expression and Tumor Angiogenesis Though Gli2 in Human Renal Cell Carcinoma [J]. Arch Med Res，2019，50（4）：225-233.

[11] ?Tolkach Y，Ellinger J，Kremer A，et al. Apelin and apelin receptor expression in renal cell carcinoma [J]. Br J Cancer，2019，120（6）：633-639.

[12] ?方開云，石明雋，肖瑛，等.原代腎小管上皮細胞的培養(yǎng)和鑒定[J].貴陽醫(yī)學院學報，2008，33（2）：136-138.

[13] ?余德芊，王富英，馬元芬，等.微分離方法原代培養(yǎng)大鼠腎近曲小管上皮細胞[J].遵義醫(yī)學院學報，2009，32（5）：448-450.

[14] ?邢傳平，錢震，李寧.腎細胞癌的組織病理和超微結構觀察[J].電子顯微學報，1997（5）：62-66.

[15] ?許紅民，李維華.腎細胞癌的超微結構分型[J].中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院學報，1990（3）：257-259，284.

[16] ?Abubakar MB，Gan SH. Molecular Targets in Advanced Therapeutics of Cancers：The Role of Pharmacogenetics [J]. Oncology，2016，91（1）：3-12.

[17] ?Okada S，Vaeteewoottacharn K，Kariya R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft （PDX） Models [J]. Cells，2019，8（8）：889.

[18] ?Meehan TF，Conte N，Goldstein T，et al. PDX-MI：Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models [J]. Cancer Res，2017，77（21）：e62-e66.

[19] ?王梨名，陳佳，陳客宏，等.小鼠近端腎小管上皮細胞原代培養(yǎng)及鑒定[J].生理學報，2018，70（4）：406-412.

[20] ?王裕，楊霞，高繼萍，等.小鼠腎小管上皮細胞的培養(yǎng)和鑒定[J].山西醫(yī)科大學學報，2014，45（11）：1106-1109， 1119.

[21] ?Vesey DA，Qi W，Chen X，et al. Isolation and primary culture of human proximal tubule cells [J]. Methods Mol Biol，2009，466：19-24.

[22] ?Qi W，Johnson DW，Vesey DA，et al. Isolation，propagation and characterization of primary tubule cell culture from human kidney [J]. Nephrology（Carlton），2007，12（2）：155-159.

[22] ?Valente MJ，Henrique R，Costa VL，et al. A rapid and simple procedure for the establishment of human normal and cancer renal primary cell cultures from surgical specimens [J]. PLoS One，2011，6（5）：e19337.

[24] ?Lobo NC，Gedye C，Apostoli AJ，et al. Efficient generation of patient-matched malignant and normal primary cell cultures from clear cell renal cell carcinoma patients：clinically relevant models for research and personalized medicine [J]. BMC Cancer，2016，16：485.

（收稿日期：2020-06-01）