陳鵬舉，史迎迎，趙慶楓，張光輝*

(1.河南省現(xiàn)代中獸醫(yī)研究院，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.周口職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 周口 466001)

乳腺炎是乳腺組織受病原微生物等感染和損傷所引起的炎性反應(yīng)，是奶牛泌乳期間常發(fā)的疾病之一，會(huì)引起奶牛產(chǎn)奶量下降、乳汁質(zhì)量不佳及死淘率增加等，嚴(yán)重危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。金黃色葡萄球菌(金葡菌)是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一[1-2]。金葡菌一旦在牛群中傳播，會(huì)引起奶牛包括慢性乳腺炎在內(nèi)的多種疾病，且很難根治。因此，準(zhǔn)確的診斷及治療乳腺炎對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

microRNAs (miRNAs)是一類(lèi)約由22個(gè)核苷酸分子組成的小型非編碼RNA，在多種物種中廣泛存在。miRNA通過(guò)與其靶mRNA相互作用，進(jìn)而參與到mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的過(guò)程中[3-5]。隨著對(duì)miRNA研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)其參與到多種疾病發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，并起到了較好的調(diào)控作用。有研究表明，miRNA在炎癥性疾病中發(fā)揮著重要的作用，如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[6]、腎臟炎[7]和心肌炎[8]等。圣草酚是一種多酚黃酮類(lèi)化合物，在蔬菜和水果中廣泛存在[9-10]。圣草酚在細(xì)胞炎癥和氧化等方面研究廣泛，其不僅能夠治療疾病，還能對(duì)疾病起到一定的預(yù)防作用[11-12]。越來(lái)越多的研究表明，藥物與miRNA之間的互作可以起到對(duì)疾病的治療作用。姜黃素通過(guò)提高miR-122的表達(dá)從而起到抗腫瘤的作用[13]，丹參酮ⅡA通過(guò)下調(diào)miR-1的表達(dá)對(duì)缺血心肌具有保護(hù)作用[14]。但是，圣草酚與miRNA之間是否具有互作機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道，還需要進(jìn)一步探討。

miRNA-128(miR-128)是眾多miRNA家族中的一員，參與到動(dòng)脈粥樣硬化和結(jié)直腸癌等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中[15-16]。髓樣分化因子(MyD88)是Toll信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵因子，在炎癥等疾病中起到信息傳遞的作用[17-18]，但miR-128與MyD88在奶牛乳腺炎中的作用機(jī)制尚不清楚。此外，在炎性反應(yīng)中，圣草酚是否與miR-128共同作用依然未知，需要進(jìn)一步探討。因此，本試驗(yàn)旨在探究圣草酚與miR-128在奶牛乳腺炎疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 金葡菌的培養(yǎng)金葡菌 (ATCC 25923)在37℃、200 r/min的搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，保存于含有25%甘油的LB培養(yǎng)基中，-80℃凍存。將過(guò)夜培養(yǎng)的金葡菌重新接種到新鮮LB培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，用離心法收集細(xì)菌，清洗并在生理鹽水中以適合的濃度重懸，以獲得最終接種物的密度。菌落形成單位(CFU)的接種量經(jīng)連續(xù)稀釋和平板計(jì)數(shù)法確認(rèn)。

1.2 乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 CCK-8測(cè)試為檢測(cè)滅活的金葡菌和圣草酚(B21160，上海源葉生物科技有限公司)是否影響細(xì)胞活力，采用CCK-8檢測(cè)試劑盒(Beyotime)檢測(cè)MAC-T細(xì)胞活力。于37℃、0.2%甲醛滅活金葡菌24～48 h，以保持金葡菌的完整形態(tài)，防止細(xì)菌生長(zhǎng)而不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。細(xì)胞接種于96孔板，密度約為4.5×104細(xì)胞/孔，于接種后0，6，12，24 h分別用金葡菌(MOI=10)刺激細(xì)胞，圣草酚分別用5，10，20 μmol/L 的量處理細(xì)胞，用新培養(yǎng)基替代孔內(nèi)舊培養(yǎng)基，并加入CCK-8試劑。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀(Thermo scientific Multiskan MK3,USA)測(cè)量D450 nm值。

1.4 miR-128模擬物及抑制劑的轉(zhuǎn)染miR-128模擬物(mimics)和抑制物(inhibitor)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，將miR-128 mimics、inhibitor和其各自的陰性對(duì)照mimic NC和inhibitor NC用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染進(jìn)MAC-T細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)染4～6 h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后收集樣品。

1.5 MAC-T細(xì)胞RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄用Trizol(Invitrogen)提取MAC-T細(xì)胞中總的RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊，南京)通過(guò)莖環(huán)法進(jìn)行miR-128的反轉(zhuǎn)錄。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR用SYBR Green染料法進(jìn)行miR-128及TNF-α、IL-1β和IL-6的測(cè)定，通過(guò)公式2-ΔΔCt計(jì)算其各自的表達(dá)量，用于定量的基因引物序列如表1所示。

表1 炎性細(xì)胞因子引物序列

1.7 雙熒光素酶試驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站分析得知MyD88是miR-128的預(yù)測(cè)靶基因，將MyD88 mRNA 3′UTR 區(qū)域的野生型(WT-3′UTR)和突變型(MuT-3′UTR)擴(kuò)增片段分別連接到psi-CHECK2載體上，使用LipofectamineTM2000將野生型及突變型載體和miR-128 mimics 或inhibitor及陰性對(duì)照共同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，24 h后裂解細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)評(píng)估報(bào)告基因活性。

1.8 ELISA試驗(yàn)按照ELISA試劑盒(Bio-Swamp)說(shuō)明書(shū)方法將收集的細(xì)胞上清液用于定量TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表達(dá)水平的測(cè)定。使用酶標(biāo)儀測(cè)量D450 nm值，并通過(guò)線性標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度。

1.9 數(shù)據(jù)分析通過(guò)GraphPad Prism 6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的計(jì)算和處理，各組數(shù)據(jù)以x±sx表示，并用t檢驗(yàn)、Two-way ANOVA進(jìn)行各組數(shù)據(jù)之間差異性的分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 金葡菌和圣草酚的細(xì)胞毒性檢驗(yàn)為了探討miR-128在MAC-T細(xì)胞中的表達(dá)變化，首先檢測(cè)圣草酚和滅活的金葡菌是否具有細(xì)胞毒性作用，通過(guò)用CCK-8試劑盒檢測(cè)MAC-T細(xì)胞，結(jié)果表明，在MOI為10時(shí)，滅活的金葡菌對(duì)MAC-T細(xì)胞的存活率沒(méi)有影響，圣草酚在3種劑量下也無(wú)明顯的細(xì)胞毒性作用(圖1)。

圖1 金葡菌和圣草酚對(duì)MAC-T細(xì)胞活力的影響 A.金葡菌對(duì)MAC-T細(xì)胞活力的影響;B.圣草酚對(duì)MAC-T細(xì)胞活力的影響

2.2 金葡菌和圣草酚對(duì)miR-128表達(dá)水平的影響為了檢測(cè)miR-128在炎性反應(yīng)中表達(dá)水平的變化，用金葡菌刺激MAC-T細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-128的表達(dá)水平隨時(shí)間變化逐漸降低，且在12 h降到最低。因此，選取12 h這一刺激節(jié)點(diǎn)，通過(guò)運(yùn)用圣草酚，結(jié)果表明圣草酚會(huì)促進(jìn)在金葡菌刺激下miR-128的表達(dá)(圖2)。

圖2 金葡菌和圣草酚對(duì)miR-128表達(dá)水平的影響 A.金葡菌對(duì)miR-128表達(dá)水平的影響;B.圣草酚對(duì)miR-128表達(dá)水平的影響。*表示差異顯著。下同

2.3 圣草酚對(duì)miR-128轉(zhuǎn)染下的炎性因子表達(dá)水平的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-128對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響，使用miR-128 mimics或miR-128inhibitor轉(zhuǎn)染MAC-T細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染mimics和inhibitor后，miR-128的表達(dá)水平穩(wěn)定，表明miR-128的轉(zhuǎn)染效率穩(wěn)定。此外，miR-128 mimics組顯著抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平，而miR-128 inhibitor則顯著提高TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平。在使用圣草酚進(jìn)一步處理之后，圣草酚會(huì)顯著降低mimics轉(zhuǎn)染下TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平，同時(shí)也顯著升高inhibitor轉(zhuǎn)染下TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平(圖3)。

圖3 圣草酚對(duì)miR-128轉(zhuǎn)染下的炎性因子表達(dá)水平的影響 A,B.miR-128分別在mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染后的表達(dá)水平；C～E.圣草酚對(duì)miR-128 mimics轉(zhuǎn)染下TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)的影響；F～H.圣草酚對(duì)miR-128 inhibitor轉(zhuǎn)染下TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)的影響

2.4 雙熒光素酶試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果為了確認(rèn)miR-128與MyD88之間的靶向關(guān)系，通過(guò)雙熒光素酶試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在WT-3′UTR中，miR-128 mimics組的熒光素酶活性顯著高于mimic NC組，而在MuT-3′UTR中，miR-128 mimics組和mimic NC組之間無(wú)顯著性差異；由此可知，MyD88是miR-128的一個(gè)靶基因(圖4)。

圖4 miR-128通過(guò)直接靶向3′UTR調(diào)控MyD88的表達(dá)

2.5 圣草酚對(duì)si-MyD88轉(zhuǎn)染下的炎性因子表達(dá)水平的影響通過(guò)干擾MyD88，探究MyD88在炎癥中的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，敲低MyD88后，TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白的表達(dá)水平會(huì)顯著升高，且在圣草酚處理之后，TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白的表達(dá)水平會(huì)進(jìn)一步降低(圖5)。

圖5 圣草酚對(duì)si-MyD88轉(zhuǎn)染下炎性因子表達(dá)水平的影響

3 討論

奶牛乳腺疾病是關(guān)乎奶牛養(yǎng)殖業(yè)安危的關(guān)鍵問(wèn)題，而在日常的養(yǎng)殖及擠奶環(huán)境下，乳腺疾病的發(fā)生同樣不可避免。金葡菌是引起奶牛疾病常見(jiàn)的一種病原菌，常會(huì)引起乳腺炎和子宮內(nèi)膜炎[19-20]，奶牛一旦感染就會(huì)很難根治。因此，有效預(yù)防及治療奶牛乳腺炎顯得至關(guān)重要。

近年來(lái)，人們對(duì)miRNA的研究日益增多，miRNA參與到多種疾病的治療之中，其中在腫瘤方面的研究較為廣泛。miR-128在腫瘤方面的研究也較多，有報(bào)道表明，miR-128會(huì)通過(guò)HTERT調(diào)控乳腺腫瘤啟動(dòng)細(xì)胞的自我更新[21]。此外，miR-128還能抑制腫瘤的生長(zhǎng)和血管的生成[22]。本試驗(yàn)首先探究了miR-128對(duì)乳腺炎的治療作用，結(jié)果顯示，miR-128會(huì)抑制相關(guān)炎性因子的表達(dá)。在奶牛乳腺炎治療方面，miRNA是一種新型的方法。圣草酚屬于一種天然二氫黃酮類(lèi)化合物，具有抗炎、抗氧化及神經(jīng)保護(hù)等方面的作用[23-26]。有研究表明，圣草酚會(huì)參與NF-κB這一經(jīng)典炎性通路的調(diào)節(jié)，在炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[27]。本試驗(yàn)將圣草酚介入到miR-128的調(diào)控中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)圣草酚會(huì)促進(jìn)miR-128的表達(dá)，且會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)miR-128對(duì)炎性反應(yīng)的抑制作用。

miRNAs通過(guò)阻斷翻譯或誘導(dǎo)靶基因的降解，為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控提供了一條新的途徑。這一過(guò)程被認(rèn)為是miRNAs組織和細(xì)胞類(lèi)型特異性表達(dá)的主要控制機(jī)制。miRNAs主要通過(guò)與其靶mRNA作用，進(jìn)而發(fā)揮其調(diào)控作用。盡管生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)了許多miR-128的靶基因，但其中某些靶基因可能與miR-128之間沒(méi)有作用。到目前為止，已經(jīng)通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證了包括蛋白受體、細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白和激酶在內(nèi)的許多基因是miR-128的靶標(biāo)[28-30]。在本試驗(yàn)中，通過(guò)TargetScan、miRBase和miRWalk網(wǎng)站預(yù)測(cè)到MyD88是miR-128的一個(gè)靶基因。雙熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-128 WT-3′UTR的熒光素酶活性顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，MyD88是金葡菌刺激后miR-128的靶點(diǎn)。

MyD88在IL-1刺激后被募集到IL-1受體復(fù)合物中，與IRAK結(jié)合后會(huì)介導(dǎo)IRAK與受體的結(jié)合[31]。此外，MyD88下游與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)聯(lián)，在炎癥相關(guān)疾病中作用重大。MyD88的抑制也進(jìn)一步導(dǎo)致下游促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表達(dá)受到抑制，緩解炎性反應(yīng)[32]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。此外，圣草酚的添加進(jìn)一步增強(qiáng)MyD88的干擾所引起的TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平的抑制作用。

綜上所述，本試驗(yàn)證明miR-128通過(guò)抑制MyD88來(lái)抑制金葡菌誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞的炎性反應(yīng)，且圣草酚進(jìn)一步增強(qiáng)miR-128對(duì)炎性反應(yīng)的抑制作用。miR-128介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可能參與了金葡菌誘導(dǎo)MAC-T細(xì)胞炎性反應(yīng)的微調(diào)。雖然本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)圣草酚增強(qiáng)miR-128的表達(dá)，但其中的作用機(jī)制還不清楚，可能與miR-128的靶基因有關(guān)，有待于進(jìn)一步的研究。