劉士奇，陳 建，查劍平，吳云輝，王仁文，鄭麗紅，王小鶯，羅軍榮,4*

(1.江西省畜禽疫病診斷與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045；2.江西中科農(nóng)牧動(dòng)物保健品有限公司，江西 南昌 330219；3.江西省鉛山縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江西 鉛山 334500；4.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物群發(fā)性疾病監(jiān)測(cè)與防控研究所，江西 南昌 330045)

早期斷奶仔豬常發(fā)生腹瀉，引起掉膘、腸炎甚至脫水死亡[1]。因此，有效防治早期斷奶仔豬腹瀉的要點(diǎn)在于如何選擇搭配不同種類的益生素，對(duì)改善仔豬腸道環(huán)境、構(gòu)建穩(wěn)定的腸道菌群尤為重要。

屎腸球菌是哺乳動(dòng)物腸道天然菌群，對(duì)維持腸道菌群平衡至關(guān)重要，尤其在幼齡哺乳動(dòng)物的腸道保健和疾病防治方面作用顯著。該菌可產(chǎn)生乳酸，定植于腸黏膜形成腸道屏障，抑制病原菌黏附腸道[2]；并代謝產(chǎn)酸抑制病原菌生長(zhǎng)，減少毒素和氨，提高消化酶活性，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[3]；同時(shí)產(chǎn)生多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子、干擾素、白細(xì)胞介素[4]等。

枯草芽孢桿菌易于保存運(yùn)輸，極其穩(wěn)定，增殖過(guò)程中產(chǎn)生枯草菌素、多黏素并能迅速消耗腸道內(nèi)的氧氣，促進(jìn)有益厭氧菌生長(zhǎng)，抑制致病菌。同時(shí)能合成各種消化酶和多種B族維生素，促進(jìn)機(jī)體消化功能和提高機(jī)體巨噬細(xì)胞活性[5-6]。

丁酸梭菌能產(chǎn)生B族維生素、維生素K、淀粉酶等，促進(jìn)動(dòng)物腸道有益菌群增殖發(fā)育，維護(hù)腸道菌群穩(wěn)定[7]；并能代謝產(chǎn)生丁酸，可修復(fù)和再生腸道上皮組織細(xì)胞[8]。

早期斷奶仔豬消化、免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，環(huán)境病原易入侵而導(dǎo)致腸炎高發(fā)。復(fù)合益生菌通過(guò)占位效應(yīng)、形成厭氧環(huán)境及促進(jìn)受損腸道修復(fù)，在臨床上防治腹瀉有顯著效果，然而對(duì)其作用機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)將以上多種益生菌進(jìn)行組合，從腸道菌群結(jié)構(gòu)及炎癥調(diào)節(jié)信號(hào)通路等層面初步探討復(fù)合益生菌防治斷奶仔豬腹瀉的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 復(fù)合益生菌復(fù)合益生菌含屎腸球菌、枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌，由江西中科農(nóng)牧動(dòng)物保健品有限公司惠贈(zèng)(批號(hào)：20180613002)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理選用20只杜長(zhǎng)大三元雜交斷奶仔豬，按體質(zhì)量、性別等分為2組：對(duì)照組(control，Con)、試驗(yàn)組(program，Pro)。試驗(yàn)期間對(duì)照組飼喂全價(jià)基礎(chǔ)日糧(NRC，2012)，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中添加1‰復(fù)合益生菌；試驗(yàn)在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，預(yù)試期7 d，試驗(yàn)周期60 d。期間自由采食和飲水，按常規(guī)生產(chǎn)模式免疫豬瘟、圓環(huán)及偽狂犬病疫苗。

1.3 樣品采集試驗(yàn)60 d后每組各隨機(jī)挑取4只仔豬，實(shí)施靜脈注射戊巴比妥(40 mg/kg)安樂(lè)死，75%酒精擦拭仔豬腹部消毒，打開仔豬腹腔將腸道完整分離出來(lái)，迅速取結(jié)腸中段組織，生理鹽水沖洗去除內(nèi)容物,同時(shí)取盲腸中段內(nèi)容物，各保存于滅菌EP管中，液氮速凍后置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 仔豬腸道菌群分析

1.4.1盲腸微生物核酸高通量測(cè)序 采用Mobio powersoil DNA提取試劑盒，提取仔豬糞便微生物基因組DNA為模板，擴(kuò)增16S RNA V3-V4區(qū)。引物序列為563F：5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′；802R：5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′，反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[9]。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段，樣本文庫(kù)制備試劑盒構(gòu)建文庫(kù)。將合格的測(cè)序文庫(kù)梯度稀釋后，依照所需測(cè)序量按比例混合，然后經(jīng)氫氧化鈉變性為單鏈，使用Illumina MiSeq 平臺(tái)(Illumina，USA)測(cè)序，測(cè)序委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.4.2生物信息學(xué)分析 測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)用FLASH軟件參照重疊堿基對(duì)初篩質(zhì)量達(dá)標(biāo)的雙端序列進(jìn)行配對(duì)和拼接。然后用QIIME軟件UCLUST比對(duì)工具(Edgar，2010)對(duì)97%序列相似度進(jìn)行合并和Operational Taxonomic Unit(OTU)劃分、過(guò)濾，基于每個(gè)樣本中OTU所含的序列數(shù)，構(gòu)建各樣本中OTU豐度的矩陣文件。以O(shè)TU中豐度最高的序列為代表序列，與QIIME軟件對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)(Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù))比對(duì)，獲取每個(gè)OTU所對(duì)應(yīng)的分類學(xué)信息。使用Qiime軟件(v1.7.0)計(jì)算樣品α多樣性指數(shù)，使用R軟件(v2.15.3)生成稀疏曲線(rarefaction curve)、豐度等級(jí)曲線(rank abundance curve),并在各個(gè)分類水平上進(jìn)行物種組成及多樣性分析，使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PICRUSt基因預(yù)測(cè)。

1.5 結(jié)腸組織炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)采用Trizol法提取仔豬結(jié)腸總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金)方法將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為PCR擴(kuò)增模板，設(shè)計(jì)炎癥調(diào)節(jié)主要信號(hào)通路(TLR/MyD88/NF-κB)相關(guān)基因的對(duì)應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 10 min;94℃ 15 s，60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán);95℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算結(jié)腸中TNF-α、IL-6、IL-10、IL-8、MyD88、NF-κB、TLR4 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

表1 炎癥相關(guān)基因引物序列

1.6 仔豬腹瀉指數(shù)觀察仔豬腹瀉指數(shù)計(jì)算方法為在試驗(yàn)期間(1～60 d)密切監(jiān)測(cè)糞便健康外觀和腹瀉評(píng)分。腹瀉的嚴(yán)重程度按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：1分，硬而成形的顆粒；2分，未成形的顆粒；3分，糞便軟；4分，非常軟，含有少量水樣糞便；5分，半固體，含有一半以上的水樣糞便；6分，水樣糞便。5分或6分被認(rèn)為是嚴(yán)重腹瀉[10]。選擇試驗(yàn)1，15，30，45，60 d的記錄結(jié)果運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析腸道微生物樣品α多樣性指數(shù)、物種組成分析、炎癥信號(hào)通路關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平及仔豬腹瀉指數(shù)運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 仔豬腸道菌群多樣性分析

2.1.1樣品序列與OTU聚類 測(cè)序結(jié)果經(jīng)FLASH軟件拼接后，對(duì)照組4個(gè)樣品分別獲得37 044，38 230，41 986，33 991條可用序列，試驗(yàn)組分別獲得45 052，48 514，44 731，48 936條可用序列。以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，兩組樣品共產(chǎn)生4 091條OTUs，其中兩組共有OTUs為2 085 條，對(duì)照組獨(dú)有OTUs為1 193條，試驗(yàn)組獨(dú)有OTUs為813條。

2.1.2α多樣性分析 圖1所示，各樣品稀釋曲線均趨于平緩，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大且合理，繼續(xù)增加測(cè)序量?jī)H能發(fā)現(xiàn)少數(shù)新的物種，可見(jiàn)測(cè)序深度能滿足測(cè)序和分析的要求。

圖1 樣品稀釋曲線

Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù)評(píng)估α多樣性：用Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)評(píng)價(jià)物種豐富度，表2中Chao1和ACE指數(shù)各樣品大小依次為Pro.4，Pro.2，Pro.1，Pro.3，Con.3，Con.2，Con.1，Con.4，說(shuō)明試驗(yàn)組各樣本物種豐度均高于對(duì)照組；而Shannon和Simpson指數(shù)是基于豐富度和均勻度2個(gè)方面評(píng)價(jià)多樣性，表2可見(jiàn)試驗(yàn)組樣品2,4,1的Shannon和Simpson指數(shù)均依次在前，其余各樣品數(shù)值排序各有交錯(cuò)，可見(jiàn)試驗(yàn)組的物種豐富度及均勻度高于對(duì)照組。

表2 樣品α多樣性指數(shù)

除Shannon指數(shù)外，試驗(yàn)組其余各指數(shù)均比對(duì)照組顯著增高(P<0.05)，說(shuō)明復(fù)合益生菌可顯著提高試驗(yàn)組物種豐富度和均勻度。

2.1.3β多樣性分析 樣本與樣本間微生物群落組成的相似性利用β多樣性進(jìn)行分析。PLS-DA法是評(píng)估β多樣性的方式之一，如果同一分組的樣本彼此之間距離越近，同時(shí)不同分組的樣本之間的距離越遠(yuǎn)，表明分類模型效果越好。由圖2可見(jiàn)，對(duì)照組各樣本高度相似，而試驗(yàn)組各樣本間有一定差異并與對(duì)照組樣本顯著區(qū)分，表明試驗(yàn)組與對(duì)照組的微生物物種多樣性存在顯著差異，可以作進(jìn)一步分析。

圖2 仔豬腸道菌群 PLS-DA圖

2.2 物種組成分析

2.2.1基于門分類水平盲腸微生物群落差異分析 本試驗(yàn)在門(phylum)和屬(genus)水平上探究復(fù)合益生菌對(duì)仔豬腸道菌群組成的影響。由表3可見(jiàn)，在門水平各組樣本生成的 OTU 主要是：厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、無(wú)壁菌門(Tenericutes)、螺旋體門(Spirochetes)。試驗(yàn)組與對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)；試驗(yàn)組厚壁菌門、變形菌門、放線菌門及無(wú)壁菌門的平均豐度均比對(duì)照組提高1.50%(P>0.05)，4.28%(P>0.05)，1.73%(P>0.05)，0.65%(P>0.05)；擬桿菌門及螺旋體門的平均豐度較對(duì)照組分別下降7.05%(P<0.05)，1.05%(P>0.05)；可見(jiàn)復(fù)合益生菌對(duì)腸道菌群有較大的調(diào)節(jié)作用，但個(gè)體間差異較大。

表3 門水平上仔豬腸道菌群組成 %

2.2.2基于屬分類水平的分析 復(fù)合益生菌對(duì)屬水平上腸道菌群組成的影響結(jié)果見(jiàn)表4。乳桿菌屬(Lactobacillus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae)、梭菌屬(Clostridiales)、毛螺菌屬(Lachnospiraceae)等為仔豬腸道中相對(duì)豐度較高的菌屬。對(duì)照組各樣本微生物主要分布在乳桿菌屬和瘤胃球菌屬,占總比56.07%，其余屬分布豐度較低，而試驗(yàn)組各屬分布均勻度顯著提高，這與α多樣性分析相印證。與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組中巨球型菌屬、擬桿菌屬、乳桿菌屬的平均豐度降低了3.86%(P>0.05),4.93%(P>0.05),18.85%(P<0.05)，而腸桿菌屬、鏈球菌屬、梭菌屬、瘤胃球菌屬平均豐度提高了4.02%(P>0.05),3.01%(P>0.05),3.94%(P>0.05),8.79%(P<0.05)。可見(jiàn)益生菌如乳桿菌屬(Lactobacillus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae)、梭菌屬(Clostridiales)等相對(duì)豐度較高，在有害菌方面，擬桿菌屬等的相對(duì)豐度有了降低。

表4 屬水平上仔豬腸道菌群組成 %

2.3 炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平TLR/MyD88/NF-κB信號(hào)通路主要基因的轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果如圖3所示，試驗(yàn)組TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8 轉(zhuǎn)錄水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而IL-10的轉(zhuǎn)錄水平則顯著高于對(duì)照組(P< 0.05)。

圖3 結(jié)腸組織炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平 Con.對(duì)照組;Pro.試驗(yàn)組;*示P<0.05；**示P<0.01

2.4 PICRUSt基因預(yù)測(cè)采用PICRUSt基因預(yù)測(cè)的方法，將得到的OTUs數(shù)據(jù)以KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)為生物代謝通路分析數(shù)據(jù)庫(kù)，列舉出代謝通路上各個(gè)KO(KEGG orthologous groups，KEGG直系同源基因簇)的具體注釋信息。圖4左側(cè)柱狀圖為不同功能基因豐度在2組中的比例，功能豐度差異顯著的用紅色標(biāo)識(shí)，可以看出腸道菌群與生物體的多種功能密切相關(guān)。在這些與生物體密切相關(guān)的功能基因中，經(jīng)過(guò)復(fù)合益生菌的作用，其中一些功能基因已經(jīng)發(fā)生差異顯著性變化。試驗(yàn)組功能基因預(yù)測(cè)平均值在以下各類中顯著(P<0.05)大于對(duì)照組：從細(xì)胞活性、環(huán)境信號(hào)處理(信號(hào)傳導(dǎo))、遺傳信息加工-轉(zhuǎn)錄這3個(gè)功能基因差異可以推測(cè)：試驗(yàn)組比對(duì)照組有更強(qiáng)的細(xì)胞活性和應(yīng)對(duì)環(huán)境改變的應(yīng)激能力。試驗(yàn)組功能基因預(yù)測(cè)平均值顯著(P<0.05)小于對(duì)照組的有：從細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、信號(hào)分子與相互作用、遺傳信息加工-折疊分類和降解、癌癥、免疫系統(tǒng)疾病、代謝疾病、糖的生物合成和代謝、萜類化合物-聚酮類化合物的代謝、核苷酸代謝這9個(gè)功能基因的差異中可以看出試驗(yàn)組比對(duì)照組有相對(duì)較低的新陳代謝，更小的發(fā)病幾率。綜合以上功能基因差異可以確定復(fù)合益生菌在減少環(huán)境應(yīng)激，降低新陳代謝，減少疾病發(fā)生方面可以發(fā)揮一定作用。

圖4 16S rRNA 測(cè)序分析2組仔豬腸道中功能基因豐度的差異

2.5 豬群腹瀉指數(shù)統(tǒng)計(jì)表5為各組仔豬腹瀉指數(shù)。由表5可見(jiàn)，試驗(yàn)1 d時(shí)組間沒(méi)有差別，各組仔豬狀況基本相同。在其他各統(tǒng)計(jì)日期，試驗(yàn)組腹瀉指數(shù)具有明顯改善，整體均出現(xiàn)下降，尤其在試驗(yàn)15，45 d，試驗(yàn)組腹瀉指數(shù)對(duì)比對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)。

表5 仔豬腹瀉指數(shù)

3 討論

利用Illumina MiSeq 高通量測(cè)序分析，通過(guò)稀釋曲線、Rank abundance曲線和α多樣性指數(shù)對(duì)樣本進(jìn)行分析，測(cè)序深度基本覆蓋腸道內(nèi)所有細(xì)菌，且各組樣品豐富度和均勻度較好，克服了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法耗時(shí)、數(shù)據(jù)不全面等缺點(diǎn)。

仔豬腸道內(nèi)寄居著種類繁多的微生物，腸道菌群構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜、龐大的生態(tài)系統(tǒng)[11]。仔豬與腸道微生物互相交換著各種活性分子，并通過(guò)腸道系統(tǒng)與其他組織系統(tǒng)互相聯(lián)系，從而影響整個(gè)機(jī)體的生理狀況，因此腸道菌群對(duì)宿主的健康至關(guān)重要[12]。研究表明，復(fù)合益生菌中的乳酸菌可通過(guò)代謝產(chǎn)生乳酸來(lái)降低腸道的pH，抑制有害菌的增殖，而枯草芽孢桿菌則會(huì)在腸道營(yíng)造出厭氧環(huán)境，從而有利于乳酸菌生長(zhǎng)，進(jìn)一步加強(qiáng)乳酸菌的功能[13]。

本試驗(yàn)表明，在門水平上，試驗(yàn)組擬桿菌門(Bacteroidetes)、螺旋體門(Spirochetes)平均豐度顯著低于對(duì)照組，而其他門的平均豐度均有所提高。在屬水平上，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，乳桿菌屬(Lactobacillus)平均豐度顯著下降，瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae)平均豐度顯著上升，梭菌屬(Clostridiales)平均豐度也呈顯著提高，與預(yù)期一致。鏈球菌屬(Streptococcus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae)、梭菌屬(Clostridiales)、毛螺菌屬(Lachnospiraceae)等菌屬的平均豐度均得到提升。仔豬飼喂60 d 后,試驗(yàn)組和對(duì)照組在腸道菌群豐富度、均勻度、群落結(jié)構(gòu)上均有顯著性差異，復(fù)合益生菌可更好地提高仔豬腸道菌群多樣性，調(diào)整菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)更多種類的益生菌在腸道內(nèi)定植繁衍，減少腸道有害菌的黏附占位，使仔豬腸道菌群健康發(fā)展[14]。

腸道菌群基因預(yù)測(cè)表明,復(fù)合益生菌的添加，降低了機(jī)體的新陳代謝，可能與飼料轉(zhuǎn)化率的提高有關(guān)聯(lián)性；同時(shí)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示試驗(yàn)組減少了因環(huán)境改變對(duì)機(jī)體應(yīng)激，降低了疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)；并增強(qiáng)了細(xì)胞的活性，加強(qiáng)了基因轉(zhuǎn)錄的保守性。腸道微生物在動(dòng)物體內(nèi)數(shù)量及種類繁多，從某種意義上可以視為動(dòng)物的一種器官或系統(tǒng)。由微生物變化推測(cè)出的基因功能預(yù)測(cè)表明復(fù)合益生菌對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)性能的發(fā)揮及提高抗病抗應(yīng)激能力具有很好的促進(jìn)作用，這也可以從腸道組織炎癥信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄水平反應(yīng)出來(lái)。

TLR/MyD88/NF-κB是Toll樣受體(TLR)下游信號(hào)通路的樞紐，當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激時(shí)，激發(fā)該信號(hào)通路并進(jìn)一步引起炎癥等反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加復(fù)合益生菌后，該通路下游抑炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平均顯著提高，而促炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。這可能與菌體和代謝物可改善動(dòng)物炎癥反應(yīng)有關(guān)，導(dǎo)致TLR的表達(dá)和IκB的降解被抑制，從而阻止NF-κB對(duì)下游因子的調(diào)控，降低MyD88的分泌，可有效防止腸道血管因炎癥因子介導(dǎo)的血管通透性上升引起腹瀉，這與試驗(yàn)組腹瀉指數(shù)低于對(duì)照組是一致的。JANG等[15]發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌可降低TNF-α、IL-6等的分泌。MIHAI等[16]也報(bào)道了屎腸球菌可刺激產(chǎn)生IL-10，發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌可降低IL-6、IL-8的表達(dá)量，結(jié)果與本試驗(yàn)相吻合。

以往的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎病理模型中，桑力軒等[17]證明了益生菌可使黏膜上皮細(xì)胞和腸黏膜的TLR4、NF-κB的表達(dá)明顯下降。NF-κB是許多細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的必經(jīng)之路，可以下調(diào)多種炎癥因子，使炎癥反應(yīng)減輕或消除，達(dá)到緩解潰瘍性結(jié)腸炎癥狀的目的。

復(fù)合益生菌可以調(diào)節(jié)紊亂的腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高菌群豐度，進(jìn)而改善機(jī)體的健康水平，降低炎癥因子的表達(dá)水平，降低腹瀉指數(shù)，防控動(dòng)物腸道炎癥的發(fā)生。由此可見(jiàn)益生素在治療和預(yù)防動(dòng)物腸道炎癥方面具有顯著作用。

謝全喜等[18]報(bào)道了復(fù)合益生菌可以調(diào)節(jié)斷奶仔豬的腸道菌群，降低胃和十二指腸內(nèi)容物pH,改善腸道菌群平衡,還能提高免疫器官的發(fā)育水平，降低斷奶仔豬腹瀉率。這與本試驗(yàn)結(jié)果相符，說(shuō)明復(fù)合益生菌可以減少仔豬應(yīng)激、減輕腸道炎癥，提高仔豬免疫功能。