王寧寧，王麗娟，李 芬,2，徐正豪，李勤凡,2*

(1.西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100；2.新疆農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

奶牛子宮內(nèi)膜炎是由于病原微生物感染等因素引起子宮內(nèi)膜發(fā)生炎癥反應，從而造成子宮內(nèi)膜層出現(xiàn)病理變化的一種疾病。該病可導致患牛屢配不孕甚至死亡[1]，對奶牛生殖系統(tǒng)帶來長期不可逆轉(zhuǎn)的影響[2]，由此造成的泌乳量下降、飼養(yǎng)成本增加甚至淘汰率升高等問題給奶牛場帶來了嚴重的經(jīng)濟損失[3]。

子宮內(nèi)膜炎主要由病原微生物感染引起，產(chǎn)后初期一些致病菌通過松弛的陰門、陰道及擴張的子宮頸進入子宮，并利用子宮內(nèi)適宜的營養(yǎng)物質(zhì)和溫度條件進行增殖。當子宮無法通過自凈過程排除致病菌時，會導致子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生[4]。其致病菌多呈混合感染，種類繁多，各地細菌種類差異明顯，主要致病菌以腸桿菌科、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、化膿隱秘桿菌和芽孢桿菌科為主。傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法費時費力，不能滿足臨床上診斷疾病的需要，多重PCR檢測方法簡單、快速且靈敏度高，便于臨床診斷中使用。本試驗針對奶牛子宮內(nèi)膜炎常見致病性大腸桿菌、化膿隱秘桿菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌、乳房鏈球菌和綠膿桿菌，建立多重PCR檢測方法，以期為奶牛子宮內(nèi)膜炎的快速診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器PTC0200 PCR擴增儀購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司；NanoDrop one核酸蛋白測定儀購自美國Thermo Fisher公司；TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye(RR901A)購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 菌株與臨床樣品所用菌株及臨床樣品均由西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院生物毒素實驗室提供。

1.3 基因組模板的制備按照Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取6種目標菌(大腸桿菌、化膿隱秘桿菌、金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌、奇異變形桿菌和綠膿桿菌)及停乳鏈球菌、松鼠葡萄球菌、淺綠氣球菌和蠟樣芽胞桿菌的基因組并進行濃度檢測。

1.4 引物設(shè)計根據(jù)致病性大腸桿菌的ycjM基因[5]、化膿隱秘桿菌的溶血素plo基因[6](登錄號：KJ150329.1)、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因nuc[7](登錄號：CP029087.1)、乳房鏈球菌的纖溶酶原激酶pauA基因[8](登錄號：AJ012548.1)、綠膿桿菌的O抗原乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因[9](登錄號：CP023255.1)、奇異變形桿菌的尿素酶合成的正向調(diào)節(jié)因子R基因[10](ureR，登錄號：Z18752.1)設(shè)計特異性引物，引物序列見表1。利用Primer 5.0軟件進行引物設(shè)計，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.5 引物的鑒定使用6種目標菌的特異性引物和基礎(chǔ)模板進行單一PCR擴增，20 μL反應體系：上、下游引物終濃度各250 nmol/L，2×TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye(RR901A)10 μL，DNA模板終質(zhì)量濃度1 mg/L，加ddH2O至20 μL。反應條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 80 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，并將測序結(jié)果與GenBank中的標準序列進行比對。

使用設(shè)計的引物對6種目標菌及停乳鏈球菌、松鼠葡萄球菌、淺綠氣球菌和蠟樣芽胞桿菌共10種細菌的混合基因組進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 引物濃度梯度測試將各個單一PCR體系中的引物進行梯度稀釋，設(shè)置終濃度為2.50×10-3，1.25×10-2，2.50×10-2，1.25×10-1，2.50×10-1，1.25 μmol/L 的6個梯度，確定各引物反應濃度范圍。

1.7 多重PCR方法的建立根據(jù)實際綜合6種致病菌單一PCR的引物濃度，設(shè)計多重PCR反應，并對多重PCR進行退火溫度梯度測試。將反應程序的退火溫度設(shè)置50，52，54，56，58，60，62℃ 7個梯度進行最適退火溫度的確定。

1.8 多重PCR特異性試驗在多重PCR反應體系中隨機加入不同種類的目的模板(終質(zhì)量濃度1 mg/L)以檢測多重PCR的穩(wěn)定性和特異性。

1.9 多重PCR敏感性試驗將體系中的模板梯度稀釋，設(shè)置終質(zhì)量濃度4×103，4×102，4×101，4，4×10-1，4×10-2，4×10-3，4×10-4μg/L 8個梯度進行最低模板質(zhì)量濃度測試。

1.10 多重PCR檢測方法的應用選取11個臨床樣品，在4 mL無菌離心管中加入2～3 mL含10%綿羊血清的LB液體培養(yǎng)基，加入至少100 μL患病奶牛的子宮內(nèi)容物，過夜培養(yǎng)。對培養(yǎng)物進行基因組提取，進行多重PCR檢測。將檢測結(jié)果與傳統(tǒng)細菌分離鑒定結(jié)果進行比較，測試多重PCR檢測方法的效果。

2 結(jié)果

2.1 引物鑒定將測序結(jié)果進行比對，各引物PCR測序結(jié)果均與目的基因同源性達99%以上。使用混合菌模板進行PCR，結(jié)果表明各單一PCR擴增結(jié)果良好，均在相應位置擴增出條帶，未見非特異性條帶出現(xiàn)(圖1)；結(jié)果證明本試驗設(shè)計的引物特異性良好。

圖1 單一PCR引物的特異性檢測 M.DL1000 DNA Marker；1.乳房鏈球菌引物；2.奇異變形桿菌引物；3.綠膿桿菌引物；4.大腸桿菌引物；5.金黃色葡萄球菌引物；6.化膿隱秘桿菌引物；7.陰性對照

2.2 單一PCR引物濃度測試對單一PCR反應體系進行引物濃度梯度測試，結(jié)果表明不同引物其最適終濃度范圍各有不同。其中乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌的適宜引物終濃度為2.50×10-2～1.25 μmol/L；奇異變形桿菌為1.25×10-2～1.25 μmol/L；大腸桿菌為1.25×10-2～2.50×10-1μmol/L；化膿隱秘桿菌為1.25×10-2～ 1.25 μmol/L；綠膿桿菌為2.50×10-2～2.50×10-1μmol/L(圖2)。

圖2 單一PCR引物濃度梯度(2.50×10-3，1.25×10-2，2.50×10-2，1.25×10-1，2.50×10-1，1.25 μmol/L和陰性對照) M.DL1000 DNA Marker；1～7.乳房鏈球菌；8～14.奇異變形桿菌；15～21.大腸桿菌；22～28.化膿隱秘桿菌；29～35.金黃色葡萄球菌；36～42.綠膿桿菌

2.3 多重PCR檢測方法的建立對多重PCR的各個引物比例及退火溫度進行調(diào)整，結(jié)果顯示,當退火溫度為58℃(圖3)，循環(huán)次數(shù)為30次，各個引物終濃度分別為乳房鏈球菌0.30 μmol/L、奇異變形桿菌0.24 μmol/L、金黃色葡萄球菌0.10 μmol/L、大腸桿菌0.15 μmol/L、化膿隱秘桿菌0.14 μmol/L、綠膿桿菌0.19 μmol/L時，6種致病菌相對應的目的條帶清晰可見。

圖3 多重PCR退火溫度梯度測試 M.DL1000 DNA Marker；1～7.50，52，54，56，58，60，62℃

2.4 多重PCR特異性試驗將6種目標菌的模板進行隨機組合并測試，進行多重PCR擴增，結(jié)果均能擴增出相應大小的目的條帶，且無其他非特異性條帶(圖4)。

圖4 多重PCR檢測方法的測試 M.DL1000 DNA Marker；1.化膿隱秘桿菌；2.金黃色葡萄球菌；3.大腸桿菌；4.綠膿桿菌；5.奇異變形桿菌；6.乳房鏈球菌；7～34.均為6種目標菌模板的隨機組合；35.陰性對照

2.5 多重PCR模板敏感度測試對多重PCR檢測方法進行模板敏感度測試，結(jié)果表明化膿隱秘桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的模板最低檢測質(zhì)量濃度為40 μg/L，綠膿桿菌、奇異變形桿菌和乳房鏈球菌的模板最低檢測質(zhì)量濃度為4 μg/L(圖5)。

圖5 多重PCR模板敏感度測試 M.DL1000 DNA Marker；1～8.4×103，4×102，4×101，4，4×10-1，4×10-2，4×10-3，4×10-4 μg/L；9.陰性對照

2.6 多重PCR檢測方法的應用使用多重PCR檢測方法對樣品DNA進行檢測，結(jié)果表明,檢測樣品均呈現(xiàn)陽性反應，其中8個樣品檢測出大腸桿菌，5個樣品檢測出化膿隱秘桿菌，1個樣品檢測出乳房鏈球菌，與細菌分離結(jié)果一致，檢測結(jié)果良好(圖6)。

圖6 多重PCR檢測方法應用 M.DL1000 DNA Marker；1～11.樣品；12.陽性對照；13.陰性對照

3 討論

奶牛子宮內(nèi)膜炎始終是奶牛產(chǎn)后主要疾病之一，其致病細菌種類繁多，難以防控。傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法診斷周期過長，不能滿足臨床需求。而多重PCR檢測方法因其簡便快速的特點，已在多種致病菌檢測、單種致病菌的準確鑒定、病毒檢測、耐藥基因和毒力基因檢測等方面廣泛應用。在國內(nèi)，食品檢測[10-11]、水源檢測[12]、乳房炎致病菌檢測[13-14]等多個方向均有多重PCR檢測方法的報道，但在子宮內(nèi)膜炎病原菌鑒定方面應用較少。

本試驗建立的多重PCR檢測方法，能有效檢測大腸桿菌、化膿隱秘桿菌、乳房鏈球菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌6種細菌。與王爽[15]建立的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌的3重PCR診斷方法，以及張維軍[16]建立的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的3重PCR診斷方法相比，本試驗建立的6重PCR診斷方法在檢測細菌種類和特異性方面均有所提升，同時，引物特異性良好，較高的退火溫度也使引物與模板結(jié)合特異性進一步提高，使疾病的檢測流程進一步簡化。在國外，近年來僅見AGHAMIRI等[6]建立了大腸桿菌、化膿隱秘桿菌、壞死梭桿菌和產(chǎn)黑色素普菌的4重PCR診斷方法，該方法特異性良好，操作簡單，但其主要致病菌種類與國內(nèi)有一定差異，因此并不適合國內(nèi)應用。本試驗建立的6重PCR診斷方法與國內(nèi)主要致病菌的分布相似度較高，同時其擴增產(chǎn)物條帶之間差異最小為86 bp，條帶間隔合理，大小清晰可辨，利于臨床實際應用。

本試驗建立的多重PCR檢測方法可檢測的最低模板終質(zhì)量濃度為4～40 μg/L，略低于夏穎等[13]1 μg/L的最低模板終質(zhì)量濃度，與陳亞明等[14]10 μg/L 的最低模板終質(zhì)量濃度以及劉駱強等[11]0.404～46.000 μg/L的最低模板終質(zhì)量濃度基本一致。與單一PCR相比，多重PCR模板敏感度顯著降低，這可能與引物之間的相互作用有關(guān)；因此在進行多重PCR檢測時可先對樣品進行細菌培養(yǎng)以增加細菌量或增大樣品量，以確保檢測結(jié)果的準確性。