張 鵬，高珍珍，馬曉彤，馬曉宇，史曉宇，吳靖澤，楊 英

(內蒙古農業(yè)大學 獸醫(yī)學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

腎臟是先天之本，主生長、發(fā)育和生殖[1]，腎臟的功能在機體中具體表現(xiàn)為推動臟腑經絡的運行,促進血液津液的循環(huán)，抵御外邪的侵犯和化生氣血津液等精微物質。腎陽虛在動物臨床是一種常見的證型也是多種疾病的共同證型[2]。腎陽虛與神經內分泌和免疫系統(tǒng)關系密切,會引起下丘腦-腺垂體-靶腺體(腎上腺、甲狀腺、性腺)軸的不同環(huán)節(jié)，不同程度的功能紊亂[3-6]。

宋代《開寶本草》中記載：列當性溫味甘，歸肝、腎、大腸經，有補腎助陽強筋之功效，補腰腎，令人有子，去風血。列當屬(Orobanchespp.)有6種藥用植物被我國少數(shù)民族作為民族藥應用[7-8]，常作為肉蓯蓉的代用品[9]。目前多數(shù)研究采用氫化可的松建立腎陽虛大鼠模型[10-14]。本試驗以蒙醫(yī)常用的黃花列當(Orobanchepycnostachya)為研究對象，測定列當水煎液對腎陽虛模型大鼠內分泌紊亂的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑黃花列當由內蒙古農業(yè)大學中獸醫(yī)實驗室提供；氫化可的松購自吉林省華牧動物保健品有限公司(批準文號：獸藥字070011270)；肉蓯蓉飲片購自安國市榮華本草中藥材有限公司(中藥飲片符合2010年版《中華人民共和國藥典》)；大鼠促性腺激素釋放激素(GnRH)ELISA試劑盒、大鼠促卵泡素(FSH)ELISA試劑盒、大鼠促黃體激素(LH)ELISA試劑盒、大鼠睪酮(T)ELISA試劑盒、大鼠雌二醇(E2)ELISA試劑盒、大鼠促甲狀腺素釋放激素(TRH)ELISA試劑盒、大鼠促甲狀腺素(TSH)ELISA試劑盒、大鼠三碘甲狀腺原氨酸(T3)ELISA試劑盒、大鼠甲狀腺素(T4)ELISA試劑盒、大鼠促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)ELISA試劑盒、大鼠促腎上腺皮質激素(ACTH)ELISA試劑盒、大鼠皮質酮(CORT)ELISA試劑盒均購自艾萊薩生物科技(上海)有限公司。

1.2 列當與肉蓯蓉水提液的制備稱取黃花列當1 000 g，加10倍量的水(即10 L)，浸泡1 h；置于自動煎藥機中水煎1 h，經3次水提后，合并3次提取液，在旋轉蒸發(fā)儀中濃縮至4 g/kg。肉蓯蓉水煎液的制備方法同上，在旋轉蒸發(fā)儀中濃縮至2 g/kg，兩者均冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動物分組健康SD大鼠36只，雌雄各半，雄性體質量(250±15) g，雌性體質量(200±15) g，購自內蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心(許可證號SCXK蒙2015-0001)，適應性飼養(yǎng)1周，期間飼喂全價飼料，自由飲水進食，室溫控制在19～25℃，相對濕度為30%～70%。將36只SD大鼠隨機分為6組(n=6)雌雄各半，即空白組、模型組、列當?shù)汀⒅?、高劑量組(1.0，2.0，4.0 g/kg)和肉蓯蓉組(2.0 g/kg)。

1.4 腎陽虛模型制備除空白組大鼠外，其他組均后肢肌肉注射氫化可的松25 mg/kg，1次/d，連續(xù)15 d[14]。造模結束后出現(xiàn)體質量下降，飲水量增加，采食量降低,皮毛色澤暗淡無光、雜亂逆立、易脫落、四肢末端及耳尖發(fā)白、精神萎靡、扎堆、拱肩縮背、蜷縮、小便清長、便溏等現(xiàn)象時認為腎陽虛模型建模成功[15-18]。建模成功后，各給藥組灌服相應藥物，對照組和模型組灌服相同劑量蒸餾水，連續(xù)30 d。

1.5 一般情況觀察試驗期間每天觀察1次動物脫毛、豎毛、蜷縮程度、精神狀態(tài)的變化。每隔7 d測定并記錄各組大鼠體質量的變化。

1.6 血清中激素的檢測試驗31 d大鼠心臟采血，分離血清，-20℃保存。采用ELISA方法按照試劑盒說明書進行操作，測定各組血清樣品中GnRH、FSH、LH、T、E2、TRH、TSH、T3、T4、CRH、ACTH、CORT的含量。

1.7 數(shù)據處理試驗數(shù)據用SPSS 22.0中的One-Way ANOVA程序進行單因素方差分析，Dunkan氏法進行多重比較，試驗結果以x±s表示，用P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 一般狀態(tài)觀察空白組大鼠在整個試驗過程中均無明顯異常表現(xiàn)；其他各組大鼠腎陽虛癥狀明顯，肌肉注射氫化可的松14 d后出現(xiàn)脫毛、毛發(fā)粗糙、黯淡無光、活動減少、體形消瘦、身體蜷縮、四肢末端及耳尖發(fā)白、扎堆、精神萎靡、反應遲鈍等肉眼可見的情況。模型組在停止造模之后，隨著時間的增加腎陽虛癥狀有一定減輕。給藥28 d后，列當?shù)汀⒅?、高劑量組和肉蓯蓉組大鼠毛發(fā)較之前順滑濃密，活動量增加，蜷縮扎堆的現(xiàn)象減少，四肢末端與耳尖顏色恢復正常，腎陽虛癥狀較此時的模型組有較大好轉。

2.2 體質量分析由表1可見，與空白組比較，給藥前的各組雌性大鼠體質量顯著降低(P<0.05)；給藥7，14，21，28 d后，與模型組比較，各給藥組均無明顯差異(P>0.05)。

表1 對雌性大鼠體質量的影響(x±s,n=3) g

由表2可見，與空白組比較，給藥前的各組雄性大鼠體質量顯著降低(P<0.05)；給藥7 d后與模型組相比，各給藥組均無顯著差異(P>0.05)；給藥14 d 后與模型組相比，肉蓯蓉組體質量顯著性增加(P<0.05)，其他給藥組無顯著性差異(P>0.05)；給藥21 d后與模型組相比，肉蓯蓉組體質量顯著增加(P<0.05)，其他給藥組無顯著性差異(P>0.05)；給藥28 d后，與模型組比較，各給藥組體質量均顯著性增加(P<0.05)。

表2 對雄性大鼠體質量的影響(x±s,n=3) g

2.3 對大鼠血清GnRH、FSH、LH、T、E2水平的影響由表3可見，與空白組相比，模型組雌鼠血清中的GnRH和E2顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)SH、LH、T顯著上升(P<0.05)。與模型組比較，各給藥組均能顯著提高腎陽虛雌性大鼠血清中的GnRH和E2(P<0.05)，降低血清中的FSH、LH、T(P<0.05)。中劑量組與肉蓯蓉組之間的各項指標均無顯著性差異(P>0.05)。隨著列當水提液濃度的增加，各給藥組血清中GnRH和E2也隨之增加，F(xiàn)SH、LH、T降低，有明顯的劑量依賴性，高劑量組與空白組各項指標均無顯著性差異(P>0.05)。

表3 雌鼠血清中GnRH、FSH、LH、T、E2含量(x±s,n=3)

由表4可見，與空白組相比，模型組雄鼠血清中GnRH顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)SH、LH和T顯著性升高(P<0.05)。中劑量組與肉蓯蓉之間的各項指標差異不顯著(P>0.05)。隨著列當水提液濃度的增加，各給藥組血清中GnRH和T也隨之升高，F(xiàn)SH、LH、E2降低。與模型組相比，高劑量組血清中GnRH和T顯著性上升(P<0.05)，F(xiàn)SH、LH、E2顯著性降低(P<0.05)，與空白相比各項指標均差異不顯著(P>0.05)。

表4 雄鼠血清中GnRH、FSH、LH、T、E2含量(x±s,n=3)

2.4 對大鼠血清TRH、TSH、T3、T4水平的影響由表5,6可見，與空白組相比，模型組血清中TRH、T3、T4顯著性降低(P<0.05)，血清中TSH的含量顯著性上升(P<0.05)。與肉蓯蓉組相比，中劑量組血清中T4的含量顯著性上升(P<0.05)，其他指標與肉蓯蓉組無明顯差異(P>0.05)。與模型組相比，高劑量組血清中TRH、T3、T4顯著上升(P<0.05)，TSH顯著降低(P<0.05)。與空白組相比，高劑量組血清中TRH、TSH、T3、T4均無顯著性差異(P>0.05)。

表5 雌鼠血清中TRH、TSH、T3、T4含量(x±s,n=3)

表6 雄鼠血清中TRH、TSH、T3、T4含量(x±s,n=3)

2.5 對大鼠血清CRH、ACTH、CORT水平的影響由表7,8可見,與空白組相比，模型組大鼠血清中的CRH、ACTH、CORT顯著降低(P<0.05)。與肉蓯蓉組相比，中劑量組血清中CRH、ACTH、CORT無明顯差異(P>0.05)。與模型組相比，高劑量組CRH、ACTH、CORT顯著上升(P<0.05)。與空白組相比，高劑量組血清中CRH、ACTH、CORT均無顯著性差異(P>0.05)。

表7 雌鼠血清中CRH、ACTH、CORT含量(x±s,n=3)

表8 雄鼠血清中CRH、ACTH、CORT含量(x±s,n=3)

3 討論

中醫(yī)認為“有諸內者，必形諸外”，通過癥狀和體征，可以“司外揣內”和“審證求因”，從而對疾病進行辨證論治[13]。腎陽虛證是對腎陽虛衰、溫煦失職、氣化失權所產生證候的高度概括。腎為命門之火，是人體陽氣之根本，與生長發(fā)育和生殖關系密切。若腎陽虛損，則可導致虛寒衰弱諸證，引發(fā)動物代謝器官、免疫器官、生殖器官等出現(xiàn)病理變化，造成功能紊亂[19-21]。

研究表明[6]，腎陽功能與神經內分泌免疫系統(tǒng)密切相關，而下丘腦-垂體-靶腺軸正常機能的發(fā)揮是機體內分泌系統(tǒng)動態(tài)穩(wěn)衡的關鍵。下丘腦分泌GnRH、CRH和TRH調節(jié)腺垂體FSH、LH、ACT-H、TSH的釋放，其中FSH和LH調節(jié)T和E2的分泌，ACTH調節(jié)CORT的分泌，TSH調節(jié)T3和T4的分泌。T、E2、CORT、T3、T4對垂體及下丘腦存在負反饋調節(jié)機制。下丘腦、垂體、靶腺在功能上聯(lián)系緊密和互相影響，構成了下丘腦-垂體-靶腺軸[22]。腎陽虛通?？梢鹦韵佥S、甲狀腺軸、腎上腺軸激素分泌異常[1]。有研究表明腎陽虛大鼠血清中GnRH水平降低，LH、FSH水平升高，在雄性動物中T降低E2升高,雌性反之[22-24]。成雅等[25]和婁勇軍等[26]研究發(fā)現(xiàn)腎陽虛可使反映下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能的CRH、ACTH、CORT下降。翟旭峰等[27]研究發(fā)現(xiàn)腎陽虛大鼠血清中TRH、T3、T4下降而TSH上升。血清中各個激素的含量與機體內分泌系統(tǒng)功能關系密切，故本試驗檢測了GnRH、CRH、TRH、FSH、LH、ACTH、TSH、T、E2、CORT共9項指標來反映機體的內分泌功能。

本試驗結果顯示，與空白組比較，模型組雄鼠體內T降低，E2、FSH、LH增高，GnRH分泌降低；模型組雌鼠體內T升高，E2降低，結果與模型組雄鼠相似，F(xiàn)SH、LH增高，GnRH含量降低；模型組雄鼠、雌鼠血液中TRH、T3、T4含量均降低，TSH含量升高；模型組雄鼠、雌鼠血液中CRH、ACTH、CORT含量均降低。提示氫化可的松所致腎陽虛模型大鼠的下丘腦-垂體靶腺軸下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)、下丘腦-垂體-甲狀腺軸(HPT)、HPA)均有不同程度的紊亂，表明腎陽虛大鼠模型成功建立。

在灌服列當水煎液之后腎陽虛大鼠血清中各項激素水平均有一定程度的恢復，在一定程度上呈現(xiàn)劑量依賴性，其中高劑量組血清中的GnRH、FSH、LH、T、E2、TRH、TSH、T3、T4、CRH、ACTH、CORT水平與空白組已無明顯差異。從試驗結果來看，列當對腎陽虛模型大鼠的3個內分泌軸(HPG、HPT、HPA)均有調節(jié)作用，對其體內的內分泌紊亂具有很好的治療效果。

列當是一種全寄生植物[28]，對我國西北地區(qū)農作物危害極大，在生產實踐上通常將其作為雜草處理[29-31]；自古以來民間就有用列當代替肉蓯蓉入藥的方法，在一定劑量下與肉蓯蓉的作用效果相似，對緩解肉蓯蓉資源匱乏，保護肉蓯蓉野外正常生長具有積極的意義。但現(xiàn)代醫(yī)學并未對其開展系統(tǒng)深入的研究，列當?shù)挠行С煞盅芯恐痪窒抻谏贁?shù)種類，臨床試驗研究也極其有限[9]，藥用價值還未得到很好的開發(fā)。本試驗為列當“變害為寶”，開發(fā)其經濟價值提供了數(shù)據參考，為今后研究其有效成分、作用機制和獸藥的開發(fā)提供了依據。