郭啟勇，陶金忠，吳心華，郭延生

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

奶牛在圍產(chǎn)期經(jīng)歷了妊娠、分娩和泌乳的巨大生理變化[1-3]。奶牛產(chǎn)后對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的需要迅速增高，日糧攝入的營(yíng)養(yǎng)元素不能滿足奶牛產(chǎn)后營(yíng)養(yǎng)需要，使奶牛發(fā)生能量負(fù)平衡(negative energy balance,NEB)[1]。NEB導(dǎo)致血糖水平降低，并動(dòng)員機(jī)體提供額外能量，致使血液中非酯化脂肪酸(NEFA)和β-羥基丁酸(BHBA)濃度升高[2]，B細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白減少[3]。高濃度的NEFA與BHBA對(duì)血液中性粒細(xì)胞功能產(chǎn)生免疫抑制的作用,增加了奶牛對(duì)外界病原微生物的易感性[4]。近年來(lái)，隨著國(guó)家減抗、限抗政策的不斷升級(jí)，開(kāi)發(fā)臨床效果好、無(wú)毒和無(wú)殘留的中獸藥制劑成為當(dāng)前獸藥研發(fā)的熱點(diǎn)[5]。歸芪益母口服液是在中獸醫(yī)經(jīng)典古方歸芪益母散的基礎(chǔ)上研發(fā)的新的中獸藥制劑。歸芪益母散出自于清代沈蓮舫《牛經(jīng)備要醫(yī)方》，由黃芪、當(dāng)歸和益母草組成。具有補(bǔ)氣生血、活血化瘀之功效，可用于促進(jìn)同期發(fā)情，治療產(chǎn)科疾病(子宮積液、不孕癥、產(chǎn)后癱瘓等)[6]。有研究表明歸芪益母散能顯著降低圍產(chǎn)后期奶牛血液中的白細(xì)胞數(shù),增加產(chǎn)后血液紅細(xì)胞的數(shù)量,提高血紅蛋白和血小板的含量[7]。目前關(guān)于歸芪益母口服液對(duì)產(chǎn)后奶牛免疫機(jī)能和生產(chǎn)性能的研究未見(jiàn)報(bào)道，因此本試驗(yàn)以免疫機(jī)能和生產(chǎn)性能為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討歸芪益母口服液對(duì)產(chǎn)后奶牛保健與疾病防治的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器和材料FACSEALIBUR流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；Fossomatic FC 全自動(dòng)乳體細(xì)胞分析儀購(gòu)自丹麥福斯電器公司 ；IgM、IgG、IgA酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；歸芪益母口服液，愛(ài)迪森(北京)生物科技有限公司提供，生產(chǎn)批號(hào)：130806。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理選擇2～4胎次荷斯坦產(chǎn)后奶牛40頭，隨機(jī)分為4組，每組10頭，低、中、高劑量組分別灌服歸芪益母口服液300，500，800 mL，空白對(duì)照組灌服溫開(kāi)水800 mL，連續(xù)灌服5 d，用藥結(jié)束后繼續(xù)觀察7 d。

1.3 外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)分別于產(chǎn)后0，5，12 d 早晨利用含有肝素的抗凝真空采血管進(jìn)行頸靜脈采血，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+，操作方法嚴(yán)格按照儀器操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 血清免疫球蛋白檢測(cè)分別于產(chǎn)后0，5，12 d早晨頸靜脈采血，3 000 r/min離心10 min分離血清，用酶聯(lián)免疫法測(cè)定各組奶牛血清IgM、IgG和IgA含量，操作方法按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.5 生產(chǎn)性能測(cè)定記錄各組奶牛用藥前、用藥后和觀察后產(chǎn)奶量，分別于產(chǎn)后0，5，12 d早、中、晚各采集乳樣50 mL，按4∶3∶3比例混合后，檢測(cè)乳成分和體細(xì)胞數(shù)，操作方法按照全自動(dòng)乳體細(xì)胞分析儀操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以x±s表示，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 歸芪益母口服液對(duì)產(chǎn)后奶牛血清免疫球蛋白的影響IgA：由表1可見(jiàn)，用藥前、用藥后與觀察后各組之間差異均不顯著(P>0.05)，各組用藥前、用藥后與觀察后之間差異均不顯著(P>0.05)。

IgM：由表1可見(jiàn)，用藥前各組之間差異不顯著(P>0.05)，用藥后和觀察后中、高劑量組之間差異不顯著(P>0.05)，但明顯高于空白對(duì)照組與低劑量組(P<0.05)，空白對(duì)照組與低劑量組之間差異不顯著(P>0.05)。空白對(duì)照組用藥后略高于用藥前(P>0.05)，其余3組用藥后明顯高于用藥前(P<0.05)；各組觀察后略高于用藥后，但差異不顯著(P<0.05)。表明產(chǎn)后奶牛隨時(shí)間延長(zhǎng)血清IgM略有升高，不同劑量的歸芪益母口服液具有一定的促進(jìn)作用，但以中劑量和高劑量效果最好，但中、高劑量組之間差異不顯著。

IgG：由表1可見(jiàn)，用藥前各組之間差異不顯著(P>0.05)；用藥后和觀察后中、高劑量組之間差異不顯著(P>0.05)，但明顯高于空白對(duì)照組和低劑量組(P<0.05)，空白對(duì)照組與低劑量組之間差異不顯著(P>0.05)。各組用藥后均明顯高于用藥前(P<0.05)，其中空白對(duì)照組與低劑量組觀察后顯著高于用藥后(P<0.05)，其余2組觀察后與用藥后組間差異不顯著(P>0.05)。表明產(chǎn)后血清IgG含量隨康復(fù)時(shí)間顯著升高，中、高劑量歸芪益母口服液具有顯著促進(jìn)作用，但兩劑量組之間無(wú)顯著性差異。

表1 不同劑量歸芪益母口服液對(duì)產(chǎn)后奶牛IgA、IgM、IgG含量的影響(x±s，n=10) g/L

綜上，中、高劑量歸芪益母口服液可顯著提高產(chǎn)后奶牛血清IgM和IgG的含量，但兩劑量組之間無(wú)明顯差異。

2.2 歸芪益母口服液對(duì)外周血淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+及其比值的影響CD4+：用藥前各組之間差異不顯著(P>0.05)；用藥后中、高劑量組之間差異不顯著(P>0.05)，但明顯高于低劑量組(P<0.05)，低劑量組明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)；觀察后空白對(duì)照組明顯低于其余3組(P<0.05)，其余3組之間差異不顯著(P>0.05)。

空白對(duì)照組用藥后明顯低于用藥前(P<0.05)，觀察后明顯低于用藥后(P<0.05)；中劑量組用藥后與觀察后之間差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于用藥前(P<0.05)；高劑量組用藥后顯著高于用藥前與觀察后，用藥前與觀察后差異不顯著(P>0.05)(表2)。說(shuō)明產(chǎn)后奶牛隨時(shí)間延長(zhǎng)外周血CD4+含量呈降低趨勢(shì)，不同劑量歸芪益母口服液有增加外周血CD4+含量的作用，以中、高劑量效果最好，但中、高劑量組之間無(wú)顯著性差異。

CD8+：用藥前各組之間差異不顯著(P>0.05)；用藥后和觀察后空白對(duì)照組和低劑量組之間差異不顯著(P>0.05)，但明顯高于中、高劑量組(P<0.05)，中、高劑量組之間差異不顯著(P>0.05)(表2)。

空白對(duì)照組和低劑量組用藥后明顯高于用藥前(P<0.05)；中、高劑量組用藥后與用藥前相比差異不顯著(P>0.05)(表2)。說(shuō)明產(chǎn)后奶牛外周血淋巴細(xì)胞亞群CD8+含量隨恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，中、高劑量歸芪益母口服液有減緩?fù)庵苎馨图?xì)胞亞群CD8+上升的作用，但兩劑量組之間差異不顯著。

CD4+/CD8+：用藥前各組之間差異不顯著(P>0.05)；用藥后高劑量組略高于中劑量組(P>0.05)，中劑量組明顯高于低劑量組(P>0.05)，低劑量組明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)(表2)。

空白對(duì)照組和低劑量組用藥后明顯低于用藥前(P<0.05)，中、高劑量組用藥后略低于用藥前(P>0.05)；中、高劑量組觀察后均明顯低于用藥后(P<0.05)，其余2組觀察后與用藥后之間差異不顯著(P>0.05)(表2)。說(shuō)明產(chǎn)后奶牛外周血淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+比值隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸呈下降趨勢(shì)，不同劑量歸芪益母口服液具有減緩產(chǎn)后奶牛外周血淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+比值升高的作用，但以中、高劑量效果最好，但中、高劑量組之間相比差異不顯著。

表2 歸芪益母口服液對(duì)產(chǎn)后奶牛外周血CD4+、CD8+及其比值的影響(x±s，n=10) %

綜上，產(chǎn)后奶牛隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，外周血淋巴細(xì)胞亞群CD4+含量逐漸降低，CD8+含量逐漸升高，以致CD4+/CD8+比值逐漸降低，中、高劑量歸芪益母口服液具有顯著的拮抗作用，兩劑量組相比，拮抗效果差異不顯著。

2.3 歸芪益母口服液對(duì)產(chǎn)后奶牛產(chǎn)奶量和乳成分的影響日產(chǎn)奶量：用藥前各組之間差異不顯著(P>0.05)；用藥后和觀察后中、高劑量組之間差異不顯著(P>0.05)，但明顯高于低劑量組和空白對(duì)照組(P<0.05)。各組用藥后均顯著高于用藥前(P<0.05)，觀察后均顯著高于用藥后(P<0.05)(表3)。表明產(chǎn)后奶牛隨時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)奶量呈逐漸增高趨勢(shì)，中、高劑量歸芪益母口服液能顯著促進(jìn)產(chǎn)后奶牛產(chǎn)奶量的升高，但中、高劑量組之間相比差異不顯著。

乳脂率、蛋白率和乳糖：各組用藥前、用藥后、觀察結(jié)束后之間差異均不顯著(P>0.05)(表3)。表明產(chǎn)后各試驗(yàn)階段乳脂率、蛋白率和乳糖無(wú)顯著變化，歸芪益母口服液也對(duì)產(chǎn)后奶牛乳脂率、蛋白率和乳糖的變化無(wú)影響。

體細(xì)胞數(shù)：用藥前各組差異不顯著(P>0.05)；用藥后空白對(duì)照組明顯高于低、中、高劑量組(P<0.05)，低、中、高劑量之間差異不顯著(P>0.05)。各組用藥后均較用藥前明顯降低(P<0.05)，觀察后均較用藥后明顯降低(P<0.05)(表3)。表明產(chǎn)后奶牛體細(xì)胞數(shù)均較高，但隨著身體機(jī)能的逐漸恢復(fù)，體細(xì)胞呈降低趨勢(shì)，不同劑量歸芪益母口服液能促進(jìn)產(chǎn)后奶牛體細(xì)胞數(shù)的降低，減少患乳房炎的潛在風(fēng)險(xiǎn)，但低、中、高劑量組之間相比差異不顯著。

表3 不同劑量歸芪益母口服液對(duì)產(chǎn)后奶牛生產(chǎn)性能指標(biāo)的影響(x±s，n=10)

3 討論

3.1 歸芪益母口服液對(duì)產(chǎn)后奶牛免疫球蛋白的影響根據(jù)最新的研究表明，歸芪益母口服液通過(guò)黃芪、益母草中的槲皮素、山奈酚、芒柄花黃素、花生四希酸、異鼠李素,當(dāng)歸中的β-谷固醇和豆甾醇發(fā)揮作用[8]。槲皮素的分子式C15H10O7，具有一定的抗炎和抗氧化的作用，減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，改善肝臟代謝[9]。山奈酚具有抗菌消炎、提高免疫力的作用[10]。芒柄花黃素是一種具有類雌二醇分子結(jié)構(gòu)的異黃酮類植物雌激素，通常具有清除自由基、抗癌、促進(jìn)雌激素分泌，研究表明對(duì)前列腺、乳腺、子宮均有促進(jìn)發(fā)育和修復(fù)損傷的作用[11]。花生四烯酸是一種長(zhǎng)鏈多不飽和酸，在動(dòng)物的炎癥及免疫反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用,在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、白細(xì)胞功能調(diào)控和血小板激活中也發(fā)揮作用[12]，并通過(guò)細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和酶反應(yīng)等方式調(diào)控機(jī)體穩(wěn)態(tài)[13]。異鼠李素能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖[14]，其機(jī)制可能與改善細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)、線粒體功能、降低Cyt-c和Caspase-9蛋白表達(dá)等線粒體凋亡通路相關(guān)指標(biāo)有關(guān)[15]。β-谷固醇具有一定的抗炎解熱鎮(zhèn)痛和促進(jìn)前列腺素的釋放作用[16]。β-谷固醇是一種強(qiáng)抗氧化劑，尤其對(duì)脂質(zhì)氧化的抑制程度很高[17]。

免疫球蛋白是機(jī)體抵御外界病原微生物侵入的防線，存在于血液和其他體液中，有特異性識(shí)別和結(jié)合抗原的能力[18]，是抗原刺激誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答中最先產(chǎn)生的免疫球蛋白[19]，主要分布于血清中。對(duì)于維持組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和體液免疫應(yīng)答至關(guān)重要。這種抗體與自身抗原和入侵的病原體結(jié)合，清除凋亡細(xì)胞和其他細(xì)胞碎片，并引發(fā)體液免疫[20]。分泌型IgA主要分布在鼻、咽、氣管、腸和膀胱黏膜的表面，是機(jī)體黏膜防御系統(tǒng)的主要成分[21]。其能抑制微生物黏膜表面附著，減緩病毒繁殖，對(duì)抗外來(lái)抗原進(jìn)入呼吸道或消化道；局部免疫系統(tǒng)遭到刺激后，無(wú)需中央免疫系統(tǒng)的參與，直接參與免疫應(yīng)答[22-23]。奶牛產(chǎn)后處于NEB狀態(tài)[24]，圍產(chǎn)期奶牛內(nèi)分泌、營(yíng)養(yǎng)代謝和生理狀態(tài)的變化，促使奶牛產(chǎn)后免疫力低下[25]，容易受到病原微生物的侵入，加大產(chǎn)后感染性疾病發(fā)生的概率[26]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，奶牛產(chǎn)后12 d內(nèi)血清IgA變化不顯著，但I(xiàn)gM、IgG逐漸升高，說(shuō)明奶牛圍產(chǎn)期免疫受到抑制[27]，但隨著恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，免疫能力逐漸恢復(fù)[28]，而中、高劑量組歸芪益母口服液可顯著提高產(chǎn)后奶牛血清IgM和IgG的含量，有助于產(chǎn)后奶牛免疫力的恢復(fù)。

3.2 歸芪益母口服液對(duì)外周血淋巴細(xì)胞亞群及其比值的影響CD4+和CD8+的比值是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能是否平衡的重要指標(biāo)，當(dāng)CD4+和CD8+細(xì)胞的數(shù)量異常或比例失調(diào)時(shí)，T淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)功能就會(huì)失去平衡[29-31]。當(dāng)發(fā)生細(xì)菌感染時(shí)，效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞增多，這與CD8+升高密切相關(guān)[31]。對(duì)抗細(xì)菌感染時(shí)，CD8+能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[32-33]。有研究表明，在正常情況下，牛CD4+/CD8+比值在2.5～4.0[34]。研究顯示葡萄球菌感染的奶牛，乳汁中CD8+增高，抑制CD4+的增殖[35]。另有研究指出奶牛圍產(chǎn)期發(fā)生感染性疾病的原因，與淋巴細(xì)胞亞群的改變有關(guān)[36]。在本試驗(yàn)中，對(duì)照組奶牛外周血CD8+呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明產(chǎn)后奶牛免疫機(jī)能失調(diào)，存在不同程度的感染[37-38]，而CD4+與CD4+/CD8+的比值均出現(xiàn)了不同程度的降低，這可能與CD8+活化有關(guān)[39-40]。不同劑量組歸芪益母口服液均能不同程度提高CD4+的數(shù)量，中、高劑量歸芪益母口服液能顯著提高CD4+的數(shù)量。不同劑量組歸芪益母口服液組用藥后CD8+同對(duì)照組一樣，出現(xiàn)不同程度的增加，但低劑量歸芪益母口服液組增加明顯，而中、高劑量組增加不明顯，說(shuō)明中、高劑量歸芪益母口服液組奶牛感染病原微生物的幾率低于低劑量組。對(duì)照組CD4+/CD8+比值隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸呈下降趨勢(shì)，不同劑量歸芪益母口服液具有減緩產(chǎn)后奶牛CD4+/CD8+比值下降的作用，但以中、高劑量效果最好，中、高劑量之間相比差異不顯著。綜上可見(jiàn)產(chǎn)后奶牛隨恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)，CD4+含量逐漸降低，CD8+含量逐漸升高，以致CD4+/CD8+比值逐漸降低，中、高劑量歸芪益母口服液對(duì)外周血淋巴細(xì)胞亞群具有一定的拮抗作用。

3.3 歸芪益母口服液對(duì)產(chǎn)后奶牛生產(chǎn)性能的影響奶牛一旦產(chǎn)后發(fā)生營(yíng)養(yǎng)代謝病或乳房炎，產(chǎn)奶量損失可達(dá)20%～70%，甚至個(gè)別奶牛將會(huì)無(wú)法泌乳，面臨被動(dòng)淘汰[41]。奶牛生產(chǎn)性能主要包括產(chǎn)奶量、乳成分和體細(xì)胞數(shù)，對(duì)生產(chǎn)性能的測(cè)定，可以預(yù)測(cè)奶牛的健康狀況，有效預(yù)防牛群疾病的發(fā)生[42]。產(chǎn)奶量是衡量奶牛泌乳性能的重要指標(biāo)[43-44]。本試驗(yàn)在相同的日糧水平和飼養(yǎng)管理水平下，中、高劑量歸芪益母口服液組顯著提高產(chǎn)奶量。這可能與歸芪益母口服液糾正奶牛產(chǎn)后能量負(fù)平衡和減少病原微生物感染有關(guān)。奶牛在60 d產(chǎn)奶周期內(nèi)，試驗(yàn)組奶牛產(chǎn)奶量一直高于對(duì)照組，說(shuō)明歸芪益母口服液對(duì)于延長(zhǎng)產(chǎn)奶周期有一定的作用。歸芪益母口服液里面的芒柄花黃素和槲皮素均有促進(jìn)雌激素分泌的作用，產(chǎn)奶量的提高可能與芒柄花黃素和槲皮素的作用有關(guān)。

牛奶體細(xì)胞數(shù)(somatic cell count,SCC) 是指每毫升牛奶中體細(xì)胞總數(shù)，SCC是反映奶牛健康的一個(gè)重要指標(biāo)，SCC通常是指乳腺脫落的上皮細(xì)胞和參與機(jī)體免疫的淋巴細(xì)胞[45-46]。當(dāng)乳腺受到外傷或者發(fā)生感染時(shí)SCC數(shù)量就會(huì)增加[47]，測(cè)定SCC變化有助于及早發(fā)現(xiàn)乳房損傷或感染(如乳房炎)，預(yù)防和治療乳房炎[48]。研究發(fā)現(xiàn)SCC的變化與產(chǎn)奶量和其他乳成分密切相關(guān)，奶牛在患乳房炎時(shí)，乳腺細(xì)胞受到破壞，導(dǎo)致乳腺分泌機(jī)能障礙，SCC升高產(chǎn)奶量減少[49]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，產(chǎn)后奶牛SCC數(shù)量均較高，但隨著身體機(jī)能的逐漸恢復(fù)，SCC呈降低趨勢(shì)，不同劑量歸芪益母口服液能降低產(chǎn)后奶牛的SCC，減少患乳房炎的潛在風(fēng)險(xiǎn)，這與歸芪益母口服液能夠提高產(chǎn)后奶牛免疫力密切相關(guān)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，中、高劑量歸芪益母口服液能顯著提高產(chǎn)后奶牛IgM、IgG、CD4+、CD4+/CD8+含量，降低CD8+含量，顯著提高產(chǎn)奶量，降低SCC，減少患乳房炎的潛在風(fēng)險(xiǎn)。