(河南醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系化學(xué)教研室,鄭州 451191)

氨基葡萄糖是人體軟骨中糖胺聚糖和透明質(zhì)酸的主要成分,能夠促進(jìn)軟骨基質(zhì)的重建,延緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病進(jìn)程。硫酸軟骨素是關(guān)節(jié)軟骨的基本組成物質(zhì),有助于促進(jìn)骨鈣沉積、幫助新骨形成,硫酸軟骨素與氨基葡萄糖結(jié)合使用能有效地保護(hù)及修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨[1]。隨著人們生活水平的提高,公眾的健康意識(shí)和健康需求也不斷增強(qiáng),氨基葡萄糖和硫酸軟骨素添加類(lèi)保健食品也越來(lái)越受到中老年人的青睞。氨基葡萄糖和硫酸軟骨素預(yù)防與修復(fù)關(guān)節(jié)炎的藥效與其含量相關(guān),含量不達(dá)標(biāo)時(shí)會(huì)影響其保健效果[2]。因此,在氨基葡萄糖和硫酸軟骨素添加類(lèi)保健食品的研制與生產(chǎn)過(guò)程中,需嚴(yán)格保證氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的添加量。

文獻(xiàn)[3]采用分光光度法測(cè)定了氨基葡萄糖與硫酸軟骨素含量。文獻(xiàn)[4]采用分光光度法測(cè)定復(fù)方硫酸軟骨素片中硫酸軟骨素含量。與化學(xué)分析法相比,高效液相色譜法更為靈敏、快速、準(zhǔn)確。文獻(xiàn)[5]采用C18色譜柱和紫外檢測(cè)器,建立了測(cè)定硫酸軟骨素和氨基葡萄糖含量的高效液相色譜法,目標(biāo)物保留時(shí)間約為2 min,不利于復(fù)雜樣品的分析。文獻(xiàn)[6]采用C18色譜柱,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,高效液相色譜法測(cè)定了硫酸軟骨素。文獻(xiàn)[7]使用強(qiáng)陰離子交換硅膠柱,采用高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方鹽酸氨基葡萄糖硫酸軟骨素片中硫酸軟骨素的含量。現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20365－2006《硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測(cè)定液相色譜法》采用C18色譜柱測(cè)定氨基葡萄糖與硫酸軟骨素。氨基葡萄糖與硫酸軟骨素在烷基色譜柱上不易保留,出峰時(shí)間在2 min左右,接近于死時(shí)間,易產(chǎn)生與雜質(zhì)共流出的現(xiàn)象;氨基葡萄糖與硫酸軟骨素在C18色譜柱上的分離度小于1.5,這影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性;所選擇的192 nm 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)不具有特異性,樣品中雜質(zhì)組分和流動(dòng)相在該檢測(cè)波長(zhǎng)處易產(chǎn)生紫外吸收,造成紫外檢測(cè)器的基線(xiàn)升高,過(guò)高的噪聲信號(hào)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。色譜柱和檢測(cè)器的選擇對(duì)于提高液相色譜法的靈敏度、選擇性及分析結(jié)果的準(zhǔn)確性具有重要的意義[8]。本工作分別采用C18色譜柱和紫外檢測(cè)器,氨基色譜柱和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,建立了2種高效液相色譜法測(cè)定保健食品中氨基葡萄糖與硫酸軟骨素,系統(tǒng)化研究了色譜柱和檢測(cè)器對(duì)高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定保健食品中氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的影響。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Alliance 2695型高效液相色譜儀,配蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)和紫外檢測(cè)器(UV);Solaris XE型氮?dú)獍l(fā)生器;CT15RE型高速離心機(jī)。

氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:5.00 g·L－1,稱(chēng)取0.500 g的氨基葡萄糖于100 mL 容量瓶中,用流動(dòng)相定容,于4 ℃冰箱保存。

硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:3.00 g·L－1,稱(chēng)取0.300 g的硫酸軟骨素于100 mL 容量瓶中,用流動(dòng)相定容,于4 ℃冰箱保存。

D-(＋)-氨基葡萄糖鹽酸鹽的純度不小于99%;硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于99%;庚烷磺酸鈉的純度大于98.0%;乙腈為色譜純;其余試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水,符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 6682－2008)的要求。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件(氨基色譜柱和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器) NH2P-50-4E氨基色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm),柱溫40 ℃;流動(dòng)相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸溶液與乙腈以體積比95∶5組成的混合液;氮?dú)鈮毫?.10×105Pa;加熱器級(jí)別75%;漂移管溫度70 ℃;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的增益值80;進(jìn)樣體積10μL;流量1.0 mL·min－1。

2)色譜條件(C18色譜柱和紫外檢測(cè)器) Symmetry C18烷基色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm),柱溫30 ℃;流動(dòng)相為10 mmol·L－1庚烷磺酸鈉溶液與乙腈以體積比95∶5組成的混合液;檢測(cè)波長(zhǎng)195 nm;進(jìn)樣體積10μL;流量1.0 mL·min－1。

1.3 試驗(yàn)方法

保健食品樣品研磨并混勻后稱(chēng)取100 mg置于錐形瓶中,加10 mL 乙腈和10 mL 水,振蕩混合后超聲提取20 min,以6 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心,取上清液。按照上述程序重復(fù)超聲提取3次,上清液合并后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,用流動(dòng)相定容后混合均勻,經(jīng)0.45μm 濾膜凈化后按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC-ELSD的建立

按色譜條件(氨基色譜柱和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器)對(duì)氨基葡萄糖和硫酸軟骨素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,其色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 氨基葡萄糖和硫酸軟骨素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖(蒸發(fā)光散射檢測(cè)器)Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of glucosamine and chondroitin sulfate(ELSD)

由圖1可知:氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的色譜峰呈正態(tài)分布,氨基葡萄糖和硫酸軟骨素在該色譜體系的分離度大于1.5,氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的色譜峰相互之間沒(méi)有干擾。

按試驗(yàn)方法(HPLC-ELSD)對(duì)保健食品樣品進(jìn)行分析,其色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 保健食品樣品的色譜圖(蒸發(fā)光散射檢測(cè)器)Fig.2 Chromatogram of the sample of health food(ELSD)

由圖2可知:在10 min內(nèi),保健食品樣品中的氨基葡萄糖和硫酸軟骨素與雜質(zhì)得到了基線(xiàn)分離,保健食品樣品中硫酸軟骨素和氨基葡萄糖的出峰時(shí)間與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中硫酸軟骨素和氨基葡萄糖的出峰時(shí)間基本一致(相對(duì)偏差＜1.0%)。

2.2 HPLC-UV的建立

按色譜條件(C18色譜柱和紫外檢測(cè)器)對(duì)氨基葡萄糖和硫酸軟骨素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,其色譜圖見(jiàn)圖3。

由圖3可知:氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的保留時(shí)間分別為2.27,1.83 min,氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的分離度小于1.5。

圖3 氨基葡萄糖和硫酸軟骨素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖(紫外檢測(cè)器)Fig.3 Chromatogram of mixed standard solution of glucosamine and chondroitin sulfate(UV)

氨基葡萄糖和硫酸軟骨素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外光譜見(jiàn)圖4。

由圖4可知:隨著檢測(cè)波長(zhǎng)的增加,氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的紫外吸收逐漸降低。試驗(yàn)選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為195 nm。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢出限

分別移取適量的5.00 g·L－1氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和3.00 g·L－1硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于100 mL容量瓶中,用流動(dòng)相定容,得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液系列中氨基葡萄糖的質(zhì)量濃度依次為20.0,40.0,80.0,150.0,300.0 mg·L－1,硫酸軟骨素的質(zhì)量濃度依次為50.0,100.0,200.0,300.0,500.0 mg·L－1。按儀器工作條件對(duì)上述氨基葡萄糖和硫酸軟骨素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定。

圖4 氨基葡萄糖和硫酸軟骨素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外光譜Fig.4 UV spectra of mixed standard solution of glucosamine and chondroitin sulfate

HPLC-ELSD 采用液相色譜工作站處理軟件Ln～Ln雙對(duì)數(shù)方程擬合氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的質(zhì)量濃度和色譜峰面積,擬合時(shí)要求相關(guān)系數(shù)的平方大于0.995 0,得到氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的線(xiàn)性范圍并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù),結(jié)果見(jiàn)表1。在線(xiàn)性范圍內(nèi),蒸發(fā)光散射檢測(cè)器響應(yīng)值的自然對(duì)數(shù)與氨基葡萄糖和硫酸軟骨素質(zhì)量濃度的常用對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系。線(xiàn)性回歸方程中,x是質(zhì)量濃度的自然對(duì)數(shù),y是色譜峰面積的自然對(duì)數(shù)。

HPLC-UV 以氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。根據(jù)3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限(3S/N),結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity ranges,linear regression equations,correlation coefficients and detection limits

2.4 方法的精密度

在空白保健食品樣品中加入100.0 mg·L－1氨基葡萄糖和硫酸軟骨素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按試驗(yàn)方法進(jìn)行分析,平行測(cè)定7次,計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知:RSD 小于1.5%。

2.5 兩種色譜方法的對(duì)比

氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的極性較強(qiáng),現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中采用反相C18柱色譜法,極性較大的化合物在弱極性的烷基柱中幾乎不保留,目標(biāo)峰出現(xiàn)在2 min左右,保留時(shí)間接近于色譜柱死時(shí)間。文獻(xiàn)[9-10]也注意到氨基葡萄糖在烷基柱上的弱保留的問(wèn)題,過(guò)短的保留時(shí)間會(huì)導(dǎo)致待測(cè)組分和樣品雜質(zhì)發(fā)生共流出現(xiàn)象,待測(cè)組分峰受到溶劑峰及雜質(zhì)峰的干擾,影響測(cè)定結(jié)果的可靠性與準(zhǔn)確性。試驗(yàn)采用中等極性的氨基色譜柱,調(diào)整有機(jī)相與水相的比例,可以控制氨基葡萄糖和硫酸軟骨素在色譜柱上的保留時(shí)間,避免了色譜保留時(shí)間過(guò)短所引起的雜質(zhì)共流出的問(wèn)題。在樣品分析過(guò)程中通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相比例,使氨基葡萄糖和硫酸軟骨素達(dá)到完全分離(分離度大于1.5)。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n＝7)Tab.2 Results of test for precision(n＝7)

氨基葡萄糖和硫酸軟骨素沒(méi)有強(qiáng)的發(fā)光基團(tuán)和特征紫外-可見(jiàn)吸收波長(zhǎng),紫外光吸收強(qiáng)度低,液相色譜法常選擇近紫外區(qū)190 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。受溶劑截止波長(zhǎng)的限制,190 nm 紫外波長(zhǎng)會(huì)引起嚴(yán)重的基線(xiàn)漂移,同時(shí)雜質(zhì)組分在近紫外區(qū)易產(chǎn)生紫外光吸收,降低了測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性。與紫外檢測(cè)器不同,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器是通用型檢測(cè)器,樣品中的基質(zhì)和流動(dòng)相溶劑對(duì)檢測(cè)信號(hào)幾乎無(wú)噪聲干擾。對(duì)于存在干擾基質(zhì)的保健食品,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器比紫外檢測(cè)器的抗干擾能力更強(qiáng),定量結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。

將2種高效液相色譜法應(yīng)用于保健食品中氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的測(cè)定,并按試驗(yàn)方法對(duì)上述樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),樣品分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品分析結(jié)果(n＝7)Tab.3 Analytical results of the samples(n＝7)

由表3可知:HPLC-ELSD 的測(cè)定結(jié)果較為準(zhǔn)確,而HPLC-UV 由于保留時(shí)間過(guò)短,無(wú)法排除雜質(zhì)的干擾,測(cè)定結(jié)果和已知值出現(xiàn)較大的偏差;在有干擾雜質(zhì)存在下,HPLC-ELSD 的回收率比HPLCUV 的回收率高?；厥章屎蚏SD 的測(cè)定結(jié)果表明:在分析復(fù)雜樣品時(shí)HPLC-ELSD 的精密度和準(zhǔn)確度更為可靠。

本工作研究了C18色譜柱和氨基色譜柱,紫外檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)高效液相色譜法測(cè)定保健食品中氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的影響。保健食品中氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在10%以上,若保健食品的基質(zhì)比較簡(jiǎn)單,則兩種方法均可以快速、準(zhǔn)確地測(cè)定氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的含量。與采用C18色譜柱和紫外檢測(cè)器的高效液相色譜法相比,采用氨基色譜柱和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器建立的高效液相色譜法對(duì)保健食品中氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的分離度更好,測(cè)定靈敏度、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度更高,適用于復(fù)雜樣品中氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的同時(shí)測(cè)定。