王慧慧 ,蘇川芬 ,荊 旭 ,畢昕媛 ,王曉聞?

(1.山西農業(yè)大學食品科學與工程學院,太谷 030801; 2.山西農業(yè)大學農業(yè)資源與經濟研究所,太原 030006)

鏈霉素是從鏈霉菌中分離得到的一種氨基糖苷類抗生素,對多種革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌有較強的抗菌活性,廣泛應用于醫(yī)療保健行業(yè)、食品生產行業(yè)和畜牧業(yè)[1]。然而,抗生素的不合理使用會導致其殘留于動物體內,并通過食物鏈富集進入人體從而造成不良影響。目前,鏈霉素的常用測定方法包括色譜法[2]、化學發(fā)光法[3]、免疫分析法[4]、分光光度法[5]、微生物法[6]和共振瑞利散射法[7]。雖然上述測定方法具有較高的準確度和靈敏度,但也存在著一些局限性,如儀器昂貴、測定時間長、樣品制備過程復雜、需要專業(yè)的操作人員[8]等。因此,需要建立一種簡單、經濟、快速、便攜的測定鏈霉素的方法。

納米材料具有表面易改性、比表面積大等優(yōu)異的物理和化學性質,在多個領域引起了廣泛的關注[9]。以金屬納米粒子為基礎的納米測定技術具有高選擇性、高靈敏度,克服了傳統(tǒng)測定方法中存在的一些問題,得到了廣泛的應用。雖然金屬納米粒子的化學合成方法多種多樣,但其中許多化學合成方法是有毒的,具有潛在的危險。相比之下,基于天然生物材料合成金屬納米粒子是一種環(huán)保的方法。近些年來,一些研究小組已經使用從單細胞生物中提取的細菌[10]和真菌以及植物部位的提取物,如天竺葵葉、檸檬草[11]和印楝葉[12]等,成功地合成了銀、金、鉛納米粒子。但利用天然生物材料合成銀納米粒子的研究還不多。與其他貴金屬納米粒子相比,銀納米粒子具有高的消光系數(shù)、清晰的消光帶、高的散射消光比和極高的電場強度[13],已經成為一種在比色傳感系統(tǒng)中可以替代金納米粒子的納米材料。在傳感過程中,銀納米粒子在一些特定的離子或抗生素的存在下呈現(xiàn)出肉眼可見的顏色變化,通過顏色的變化來確定目標物的化學成分及含量。因為局域表面等離子體共振效應對銀納米粒子的組成、大小和形狀高度敏感,所以銀納米粒子具有顯著的響應視覺顏色變化能力,因此它可以作為強大的光學傳感器。近年來,銀納米粒子已用于重金屬離子[14]、蛋白質[15]、脫氧核糖核酸(DNA)[16]、生物藥物[17]、細菌[18]等的測定。

隨著科技的發(fā)展,智能手機擁有強大的處理器、高清顯示觸摸屏、高像素攝像頭、無線傳輸模塊和各種傳感器元件。而且,智能手機越來越小型化、完善化、自動化和智能化,已成為一種潛在的便攜分析設備[18-20]。智能手機能夠分析試驗結果、增強信號、與其他設備共享或傳輸數(shù)據,是一種帶有數(shù)字平臺的便攜式設備。因此,可以將高度靈敏的納米技術與高效便捷的智能手機相結合,創(chuàng)建一種智能的納米生物傳感器。

本工作利用天然產物槲皮素和硝酸銀合成一種穩(wěn)定的銀納米粒子。合成的銀納米粒子能夠特異性地識別鏈霉素,溶液顏色由黃色變?yōu)闄烟壹t色,由智能手機記錄結果并進行數(shù)據分析。本工作通過納米技術與智能手機相結合,將生物信號轉換為可讀信號,利用智能手機的數(shù)字化處理功能,依據紅(R)綠(G)藍(B)模型對試驗結果進行分析,根據顯色程度實現(xiàn)了牛奶中鏈霉素殘留量的快速測定,本方法具有速率快、成本低、選擇性好、綠色環(huán)保等優(yōu)點。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Cary 60 型紫外分光光度計;ST 3100 型p H計;iPhone 5S型智能手機。

鏈霉素標準儲備溶液:1 mmol·L－1,稱取硫酸鏈霉素標準品0.072 9 mg于50 mL容量瓶中,用適量水溶解并稀釋至刻度,于4 ℃冰箱中保存,備用。使用時用水稀釋至所需濃度。

槲皮素的純度不小于98.5%;所用試劑均為分析純;試驗用水為二級蒸餾水。

1.2 試驗方法

1.2.1 銀納米粒子的合成

將100 μmol·L－1硝酸銀溶液(40 mL)與100μmol·L－1槲皮素溶液(10 mL)按體積比4∶1置于100 mL的燒杯中。然后將燒杯置于磁力攪拌器上于恒溫(50 ℃)下攪拌5 min,再逐滴加入15 mmol·L－1碳酸鈉溶液1 mL,攪拌幾分鐘后上述混合溶液由無色變?yōu)辄S色,并且隨攪拌時間的延長逐漸變暗,繼續(xù)攪拌1 h后,最終合成了槲皮素包覆的銀納米粒子。用1 mol·L－1鹽酸溶液或1 mol·L－1氫氧化鈉溶液調節(jié)上述溶液pH 至7.5,避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品預處理

移取5 mL牛奶樣品置于10 mL 離心管中,加入1 mol·L－1亞鐵氰化鉀溶液100μL 混勻,然后加入0.25 mol·L－1乙酸鋅溶液100μL 混勻,以5 000 r·min－1轉速離心5 min,去除蛋白質等雜質。上清液過濾膜(0.22μm)后,于冰箱(－4 ℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 鏈霉素的測定

移取1 mL合成的銀納米溶液于1.5 mL 的玻璃瓶中,加入10μL 牛奶樣品濾液。裸眼觀察溶液的顏色,顏色穩(wěn)定后用iPhone 5S的高分辨率攝像頭對上述試驗結果進行拍照。使用手機上安裝的應用程序(取色器)獲取有效區(qū)域相對應的RGB 值,計算G/B值。

2 結果與討論

2.1 槲皮素包覆的銀納米粒子的合成機理

槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮,Qt)是擁有多種生物活性的一種黃酮醇類化合物,它具有較高的超離域度、完整的大π鍵共軛體系、強配位氧原子和獨特的空間構型,可作為金屬離子的良好空間配體。在合成銀納米粒子的過程中,首先硝酸銀在加熱的條件下形成銀單質,然后槲皮素分子的－OH和C＝O 與銀單質相互作用從而形成槲皮素包覆的銀納米粒子。加入碳酸鈉溶液后,槲皮素分子因其3-OH 和4′-OH 這2個羥基在堿性溶液中不穩(wěn)定,易開環(huán)轉變?yōu)椴槎?從而使得溶液顏色由無色轉變?yōu)辄S色,并且在不斷攪拌的過程中,溶液與空氣較長時間接觸,使得顏色加深,最終形成穩(wěn)定的槲皮素包覆的銀納米粒子。

2.2 紫外-可見吸收光譜

100μmol·L－1槲皮素-15 mmol·L－1碳酸鈉的混合液、銀納米溶液、100μmol·L－1槲皮素溶液、100μmol·L－1硝酸銀溶液和15 mmol·L－1碳酸鈉溶液等5種反應體系的紫外-可見吸收光譜見圖1。

圖1 5種反應體系的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of the 5 reaction systems

由圖1可知:只有硝酸銀與槲皮素混合后且加入一定量的碳酸鈉溶液攪拌一段時間后,在波長410 nm 處才出現(xiàn)了銀納米粒子的特征吸收峰,且裸眼觀察為黃色,這是因為銀納米比色探針存在表面等離子體共振效應[21]。

鏈霉素加入前后銀納米溶液的紫外-可見吸收光譜和照片見圖2。

圖2 鏈霉素加入前后銀納米溶液的紫外-可見吸收光譜和照片F(xiàn)ig.2 UV-Vis absorption spectra and photograph of silver nanoparticle solution before and after adding streptomycin

由圖2可知:加入鏈霉素之后,波長410 nm 處的吸光度明顯降低,波長550 nm 處的吸收峰顯著增強。這是由于在槲皮素包覆的銀納米溶液中加入鏈霉素后,鏈霉素中的－OH 和－NH2與槲皮素中的－OH 通過氫鍵作用形成網狀結構,導致銀納米粒子的聚集,使溶液由黃色變?yōu)闄烟壹t色[22]。這說明了合成的銀納米粒子對鏈霉素比色測定的適用性。

2.3 反應條件的選擇

2.3.1 硝酸銀和槲皮素的用量之比

將100μmol·L－1硝酸銀溶液和100μmol·L－1槲皮素溶液分別按體積比2∶1,3∶1,4∶1,5∶1混合,按試驗方法合成銀納米粒子,用iPhone 5S智能手機分別拍攝每個體積比下合成的銀納米溶液的照片。由RGB模型處理得到的G/B值和銀納米溶液的照片見圖3。

圖3 硝酸銀和槲皮素的用量之比對銀納米溶液的G/B值和照片的影響Fig.3 Effect of ratio of Ag NO3 to Qt on G/B value and photograph of silver nanoparticle solution

由圖3可知:隨著100μmol·L－1硝酸銀溶液和100μmol·L－1槲皮素溶液的體積比的增加,槲皮素包覆的銀納米粒子的顏色由無色逐漸變成淡黃色,G/B值逐漸變大;當100μmol·L－1硝酸銀溶液和100μmol·L－1槲皮素溶液的體積比為4∶1時,槲皮素包覆的銀納米粒子的顏色最深,G/B 值最大,說明此時合成的銀納米粒子吸光度最大;繼續(xù)增加100μmol·L－1硝酸銀溶液和100μmol·L－1槲皮素溶液的體積比時,槲皮素包覆的銀納米粒子的顏色由淡黃色變成無色,G/B 值降低,這可能是由于銀離子的聚集使得銀納米粒子的合成減少導致吸光度減小。試驗選擇100μmol·L－1硝酸銀溶液和100μmol·L－1槲皮素溶液的體積比為4∶1來制備槲皮素包覆的銀納米粒子。

2.3.2 反應體系的酸度

合成的銀納米溶液在不同的酸度下顏色不同,用1 mol·L－1鹽酸溶液或1 mol·L－1氫氧化鈉溶液調節(jié)銀納米溶液的酸度,用智能手機拍攝得到調整酸度后的銀納米溶液的照片。銀納米溶液的酸度會對鏈霉素的測定結果造成影響,不同酸度的銀納米溶液加入鏈霉素后,反應體系出現(xiàn)的顏色不同。鏈霉素加入前后銀納米溶液的照片見圖4。

圖4 鏈霉素加入前后銀納米溶液的照片F(xiàn)ig.4 Photographs of silver nanoparticle solution before and after adding streptomycin

由圖4可知:pH 為2.0時,在強酸性環(huán)境下,銀納米溶液的顏色為無色,這可能是因為槲皮素在酸性條件下閉環(huán),從而恢復完整的黃酮醇結構,使溶液顏色由黃色變?yōu)闊o色;隨著pH 的升高,銀納米溶液的顏色逐漸變深;加入鏈霉素后,隨著pH 的升高,反應體系的顏色由無色逐漸轉變?yōu)闄烟壹t色;p H為7.5時,反應體系的顏色變化最明顯,反應體系為櫻桃紅色;繼續(xù)升高p H,反應體系的顏色逐漸變淡;pH 為10時,反應體系為淡黃色。

鏈霉素加入前后銀納米溶液的G/B值見圖5。

圖5 鏈霉素加入前后銀納米溶液的G/B值Fig.5 G/B values of silver nanoparticle solution before and after adding streptomycin

由圖5可知:pH 為2.0時,銀納米溶液的G/B值最小;繼續(xù)升高p H,銀納米溶液的G/B值逐漸增大;pH 為7.0時,銀納米溶液的G/B 值最大;繼續(xù)升高p H,銀納米溶液的G/B 值逐漸趨于平穩(wěn)。這表明:隨pH 的增加,銀納米溶液的G/B值、顏色在pH 為7.0時趨于穩(wěn)定。加入鏈霉素后,隨著pH 的升高,反應體系的G/B 值先是較平穩(wěn),然后逐漸升高。為了準確衡量反應體系的酸度對鏈霉素測定的影響,用未加入鏈霉素時銀納米溶液的G/B值與加入鏈霉素后銀納米溶液的G/B 值的差值Δ(G/B)表示最終的試驗結果。Δ(G/B)越大,說明反應體系顏色變化越大。

反應體系的酸度對Δ(G/B)的影響見圖6。

圖6 反應體系的酸度對Δ(G/B)的影響Fig.6 Effect of acidity of reaction system onΔ(G/B)

由圖6 可知:隨著pH 的升高,反應體系的Δ(G/B)逐漸增大;pH 為7.5時,反應體系的Δ(G/B)最大;pH 大于7.5時,反應體系的Δ(G/B)顯著降低。這說明銀納米溶液的堿性越強,加入鏈霉素后反應體系顏色的變化程度不明顯,特別是在p H為10時,裸眼觀察(圖4)即可知加入鏈霉素后銀納米溶液顏色與加鏈霉素前銀納米溶液的顏色相差不大?？赡苁倾y納米溶液在堿性條件下穩(wěn)定,而鏈霉素在強堿性條件下易水解失效,導致溶液顏色不發(fā)生改變。試驗選擇反應體系的酸度為pH 7.5。

2.4 干擾試驗

為了驗證方法的特異性,試驗考察了不同種類的抗生素對鏈霉素測定結果的影響。分別將鏈霉素(a)、氟苯尼考(b)、氯霉素(c)、紅霉素(d)、氟康唑(e)和頭孢噻呋(f)以相同的濃度(100.00μmol·L－1)添加到銀納米溶液(A)中,抗生素加入前后銀納米溶液的照片見圖7。

圖7 抗生素加入前后銀納米溶液的照片F(xiàn)ig.7 Photographs of silver nanoparticle solution before and after adding antibiotics

由圖7可知:氟苯尼考、氯霉素、紅霉素、氟康唑和頭孢噻呋對鏈霉素的測定無顯著性干擾。這表明槲皮素包覆的銀納米粒子對鏈霉素有較高的特異性。

2.5 標準曲線、檢出限和測定下限

按試驗方法對10.00,30.00,50.00,70.00,90.00,110.00,130.00,150.00μmol·L－1的鏈霉素標準溶液系列進行測定,以鏈霉素的濃度為橫坐標,對應的G/B值為縱坐標繪制標準曲線。結果表明:鏈霉素的濃度在10.00～150.00μmol·L－1內與其對應的G/B 值呈線性關系,線性回歸方程為y＝－1.800×10－3x＋1.266,相關系數(shù)為－0.998 7。

以3倍標準偏差除以標準曲線斜率計算方法的檢出限(3s/k),結果為0.63μmol·L－1;以10倍標準偏差除以標準曲線斜率計算方法的測定下限(10s/k)[23],結果為2.08μmol·L－1。

2.6 樣品分析

按試驗方法對市售的純牛奶樣品進行分析,在純牛奶樣品中未檢出鏈霉素。對純牛奶樣品進行加標回收試驗,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),并與紫外分光光度法[24]結果進行對比。樣品分析結果見表1。

表1 樣品分析結果(n＝6)Tab.1 Analytical results of the samples(n＝6)

由表1可知:回收率為97.9%～102%,RSD 為0.90%～2.8%;本方法的測定值與紫外分光光度法[24]的測定結果相一致。

本方法準確可靠,可用于實際牛奶樣品中鏈霉素殘留量的測定。

2.7 方法對比

本方法與其他文獻報道的鏈霉素測定方法的對比見表2。

表2 測定鏈霉素的不同方法的對比Tab.2 Comparison of different methods for streptomycin determination

本工作開發(fā)了一種槲皮素包覆的銀納米粒子測定鏈霉素殘留量的方法。方法中采用天然綠色、安全可靠的植物提取物合成銀納米粒子,并對合成的銀納米粒子進行了表征。在最優(yōu)的測定條件下,合成的銀納米粒子對鏈霉素表現(xiàn)出高度靈敏性和適用性。結合智能手機的高分辨率攝像頭及應用程序捕獲的RGB值,方法對試驗結果進行分析,實現(xiàn)了鏈霉素的便攜式測定。方法已成功用于測定牛奶樣品中鏈霉素的殘留量。本工作提供了一種簡單、快速、有效、綠色環(huán)保的測定牛奶中鏈霉素殘留量的方法,也為智能手機在食品安全應用程序的開發(fā)中提供了理論基礎,具有廣闊的應用前景。