黃景軍,魏潤平,黃春仁,何家瑞,鄧賢銘,馬細(xì)蘭,李水生,張 勇,周立斌

(1.惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,廣東 惠州 516081;2.中山大學(xué) 水生經(jīng)濟(jì)動物研究所暨廣東省水生經(jīng)濟(jì)動物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510275;3.海南晨海水產(chǎn)有限公司,海南 三亞 572000;4.海南德益豐水產(chǎn)科技有限公司,海南 文昌 571000;5.西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,昆明 650224)

0 引言

斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides),屬于鱸形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑魚亞科(Epinephelinae)、石斑魚屬(Epinephelus)[1],為廣鹽性暖水性中下層魚類,主要分布于太平洋和印度洋的熱帶及亞熱帶海區(qū)[2].斜帶石斑魚生長快、適應(yīng)性強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富,是我國南方沿海海水養(yǎng)殖的高檔經(jīng)濟(jì)魚類[3].斜帶石斑魚是典型的雌雄同體魚類,一般雌性性成熟之后,再經(jīng)歷性逆轉(zhuǎn)過程,變?yōu)樾坌?性腺內(nèi)精原細(xì)胞開始增殖發(fā)育直至占主導(dǎo)地位之后,才具有雄性生殖功能,一般情況下發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的年齡至少在4齡以上[4].斜帶石斑魚的性腺發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)受到遺傳因素和外部環(huán)境因素影響.針對斜帶石斑魚的性別發(fā)育和性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象,我國研究人員從遺傳因素包括性別決定相關(guān)基因以及生殖內(nèi)分泌調(diào)控的促性腺激素(Gonadotropin,GtH),即促卵泡激素(Follicle-stimulating Hormone,FSH)和促黃體激素(Luteinizing Hormone,LH)等方面開展了系統(tǒng)的研究,而在外部環(huán)境因素方面,則主要從群體中的性別比例、層級關(guān)系、打斗現(xiàn)象等社會學(xué)角度開展研究[5].

INAD(Inactivation no after-potential D)蛋白定位于果蠅光感受器的微絨毛上,是一種典型的支架蛋白,負(fù)責(zé)介導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)級聯(lián)視覺信號通路,調(diào)控果蠅視覺信號的傳導(dǎo),其核心功能結(jié)構(gòu)由5個PDZ結(jié)構(gòu)域串聯(lián)組成[6].PDZ結(jié)構(gòu)域由80～100個氨基酸組成,其標(biāo)志性結(jié)構(gòu)包括6個β折疊和2 個α螺旋,是介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間相互作用的經(jīng)典結(jié)構(gòu)域.PDZ 結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識別配體靶蛋白C 末端氨基酸序列(-X-S/T-X-Ф,X是任意殘基,Ф 是疏水殘基)[7].這種PDZ結(jié)構(gòu)域廣泛分布于神經(jīng)遞質(zhì)受體、離子通道的胞內(nèi)段,是受體、離子通道向胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)、錨定的必備條件[8].在黃顙魚的研究中有學(xué)者構(gòu)建了YY超雄黃顙魚的BAC文庫并篩選到了包含性別連鎖標(biāo)記Pf62-Y的BAC克隆,對BAC克隆進(jìn)行測序鑒定到了新基因INAD,并推測該INAD基因可能跟黃顙魚性別調(diào)控相關(guān)[9-10].

本研究以斜帶石斑魚為研究對象,通過克隆獲得INAD基因序列,并通過QRT-PCR定量分析的方法,研究了INAD基因在斜帶石斑魚中的組織差異性表達(dá),以及在不同時期性腺中的差異性表達(dá).另外,本研究還分析了注射促卵泡激素(FSH)或促黃體激素(LH)兩種激素對INAD基因表達(dá)的影響等,初步探究了INAD基因與斜帶石斑魚性別決定與分化存在可能關(guān)聯(lián),為斜帶石斑魚性別決定的研究提供新的思路.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物處理

實(shí)驗(yàn)用斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides),雌魚3齡,雄魚4～5齡,來自廣東省海洋漁業(yè)試驗(yàn)中心,通過不間斷的抽取海水并過濾來飼養(yǎng).麻醉后,測其體長體質(zhì)量,進(jìn)行活體解剖取出各組織器官,液氮速凍保存帶回實(shí)驗(yàn)室,存放于-80 ℃冰箱備用.共提取17個組織的樣品,分別為:嗅球、端腦、中腦、小腦、延腦、下丘、垂體、心臟、肝臟、胃、性腺、頭腎、腎臟、皮膚、肌肉、鰓、脾臟.同時,提取處于不同發(fā)育時期性腺組織樣品,即卵巢、兼性性腺、精巢各四個.

注射用促卵泡激素(寧波市三生藥業(yè)有限公司)與注射用促黃體激素(寧波市三生藥業(yè)有限公司)溶于0.5 mL 0.9%生理鹽水,實(shí)驗(yàn)組分為兩組(n=12)每兩周分別腹腔注射FSH 200 UI/尾或200 UI/尾LH,對照組注射等量(0.5 mL)生理鹽水,共注射2次,每次注射后第15天活體抽取適量性腺,用于后續(xù)的QRT-PCR分析.

1.2 斜帶石斑魚INAD基因克隆和序列分析

采用Trizol試劑(Invitrogen,USA)從性腺組織中提取總RNA,總RNA純度用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,通過NanoDrop2000核酸蛋白檢測儀對總RNA濃度測定.按照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche,德國)說明書將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA.根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),獲取了其余INAD基因的序列,根據(jù)已知序列兩端信息設(shè)計RACE(rapid-amplification of cDNA ends)引物,擴(kuò)增出片段.在此基礎(chǔ)上,設(shè)計擴(kuò)增引物,從而獲得INAD基因的完整ORF序列(表1).

表1 斜帶石斑魚INAD基因克隆與分析所用的引物序列

1.3 氨基酸序列的同源性比對

采用了如下9種魚類INAD基因的表達(dá)產(chǎn)物氨基酸序列,利用BioEdit軟件進(jìn)行了同源性分析.這9種魚類:鱸形目的斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)、奈里樸麗魚(Pundamilianyererei)和大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris);鳉形目的茉莉花鳉(Poecilialatipinna)和花斑劍尾魚(Xiphophorusmaculatus);狗魚目的白斑狗魚(Esoxlucius);鯉形目的斑馬魚(Daniorerio)和鯉魚(Cyprinuscarpio);鲇形目的斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus).

1.4 INAD基因的進(jìn)化樹分析

在本步驟中,選取11種魚類：鱸形目的斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)、大黃魚(Larimichthyscrocea)、奈里樸麗魚(Pundamilianyererei)和大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)，鳉形目的茉莉花鳉(Poecilialatipinna)、秀美花鳉(Poeciliaformosa)和花斑劍尾魚(Xiphophorusmaculatus)，狗魚目的白斑狗魚(Esoxlucius)，鯉形目的斑馬魚(Daniorerio)和鯉魚(Cyprinuscarpio);鲇形目的斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus);還選取了哺乳綱的黑猩猩(Pantroglodytes)、人(Homosapiens)、倭狐猴(Microcebusmurinus)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、家牛(Bostaurus)，鳥綱的雙領(lǐng)鸻(Charadriusvociferus)、暴雪鹱(Fulmarusglacialis)、大杜鵑(Cuculuscanorus)共19個物種；利用MEGA 7對INAD基因進(jìn)行多重序列比對,并進(jìn)一步繪制進(jìn)化樹.

1.5 組織表達(dá)檢測

采用β-actin基因作為內(nèi)參基因,對斜帶石斑魚INAD基因在17個組織的表達(dá)進(jìn)行RT-PCR檢測.加樣體系為:12.5 μL PCR Mix(2×),10.5 μL無菌水,0.5 μL上游引物,0.5 μL下游引物,1 μL cDNA模板.RT-PCR的程序如下:95 ℃預(yù)變性30 s,1個循環(huán);95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共進(jìn)行循環(huán)40次;最后72 ℃延伸5 min;4 ℃保存.PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析.

1.6 性腺表達(dá)檢測

在Roche Light Cycler 480(Roche,德國)實(shí)時熒光定量PCR 儀上進(jìn)行qPCR 分析,檢測INAD基因在性腺不同發(fā)育時期和激素處理后的表達(dá),以β-actin作為內(nèi)參基因.參照試劑盒說明書及LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche)說明書進(jìn)行,反應(yīng)體系為:5 μL SYBR-Green,0.4 μL上游引物,0.4 μL下游引物,0.5 μL 各組織cDNA模板,3.7 μL去離子水.反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性60 s,1個循環(huán);95 ℃變性15 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸,20 s,共循環(huán)40 次.運(yùn)用2-ΔΔCt方法計算INAD基因的相對表達(dá)量.

1.7 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)采用Mega7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,所得數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,先對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),再對有顯著性差異的數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan氏多重比較,P<0.05則表示差異顯著.

2 結(jié)果

2.1 斜帶石斑魚INAD基因序列分析

通過RACE-PCR擴(kuò)增后,再經(jīng)膠回收、連接轉(zhuǎn)化、驗(yàn)證及公司測序系列操作得到單一的片段后,通過使用BLAST和ORFfinder軟件分析后,獲得斜帶石斑魚INAD基因的ORF區(qū)段序列,共5 337 bp.根據(jù)真核生物的密碼子表,將INAD基因的ORF的核酸序列,翻譯為相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(圖1).

表示軟件預(yù)測的PDZ 結(jié)構(gòu)域.圖1 INAD基因的cDNA ORF核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖1(續(xù))

2.2 斜帶石斑魚INAD基因同源性分析

2.2.1 氨基酸序列的同源性比對

獲得了斜帶石斑魚INAD基因所編碼蛋白的氨基酸序列后,從網(wǎng)上已知數(shù)據(jù)庫中查詢到多種其他魚類中INAD基因表達(dá)產(chǎn)物(蛋白)的氨基酸序列,通過對屬于鱸形目、鳉形目、鯉形目、狗魚目和鲇形目的幾種魚類的INAD基因編碼的蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(表2),可以發(fā)現(xiàn)該蛋白都分別在不同魚類中均具有一定的同源性,主要集中在氨基酸序列25～521 bp、658～768 bp、919～1 017 bp、1 322～1 451 bp、1 572～1 685 bp、1 869～2 041 bp以及2 183～2 383 bp(圖2).

表2 斜帶石斑魚INAD與其他已知INAD同源序列氨基酸比對

圖2(續(xù))

2.2.2INAD基因的進(jìn)化樹分析

通過鄰接法(Neighborjoining)構(gòu)建了基于INAD基因序列的系統(tǒng)發(fā)生樹,在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹時,用Bootsrap value 法檢驗(yàn),1 000 次重復(fù)抽樣得到節(jié)點(diǎn)的置信度以自引導(dǎo)值估計.結(jié)果顯示:由INAD基因構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)生樹得出斜帶石斑魚與鱸形目的大黃魚最先聚到一支,之后與奈里樸麗魚再聚到一起,之后再依次與鳉形目中的花斑劍尾魚、茉莉花鳉和秀美花鳉聚到一起,合為一個分支再與鱸形目的大彈涂魚聚到一起,再合為一個分支與狗魚目的白斑狗魚、鯉形目的斑馬魚和鯉魚及鲇形目的斑點(diǎn)叉尾鮰聚到一起.斜帶石斑魚INAD基因與哺乳綱和鳥綱處于較遠(yuǎn)的不同分支(圖3).

圖3 幾個物種INAD基因的進(jìn)化系統(tǒng)樹 注:從GenBank中選出的其他物種基因的序列號是大黃魚(KKF11065.1)、奈里樸麗魚(XP_005732471.1)、大彈涂魚(XP_020787702.1)、茉莉花鳉(XP_014870465.1)、秀美花鳉(XP_016521813.1)、花斑劍尾魚(XP_014329708.1)、白斑狗魚(XP_012990420.1)、斑馬魚(NP_001120657.1)、鯉魚(XP_018920765.1)、斑點(diǎn)叉尾鮰(AHH42714.1)、黑猩猩(JAA40750.1)、人(NP_001337074.1)、倭狐猴(XP_012622537.1)、褐家鼠(NP_536323.1)、家牛(DAA31268.1)、雙領(lǐng)鸻(KGL92467.1)、暴雪鹱(KFV96570.1)、大杜鵑(KFO82237.1).

2.3 斜帶石斑魚INAD基因在不同組織以及不同時期性腺中的表達(dá)

2.3.1 RT-PCR檢測INAD基因的組織差異性表達(dá)的結(jié)果

INAD基因在端腦檢測不到表達(dá),在嗅球、中腦、小腦、延腦、下丘、垂體、心臟、肝臟、胃、性腺、頭腎、腎臟、皮膚、肌肉、鰓、脾臟等16個組織中均檢測到表達(dá)(圖4).表明該基因可能在魚體中多個組織均發(fā)揮著重要的作用.

圖4 斜帶石斑魚INAD基因在17個組織中的表達(dá)特異性電泳圖注:a為INAD基因;b為內(nèi)參基因.

2.3.2 斜帶石斑魚INAD基因不同時期性腺中的表達(dá)結(jié)果

INAD基因在斜帶石斑魚不同時期的性腺,包括雌性狀態(tài)魚體中的卵巢、雄魚狀態(tài)魚體中的精巢、雌性狀態(tài)魚體將要性逆轉(zhuǎn)為雄魚狀態(tài)魚體狀態(tài)的兼性性腺,具有相對較高的表達(dá)量,這說明了INAD基因可能在性腺之中發(fā)揮著某種重要作用.值得注意的是,INAD基因的表達(dá)量依次從卵巢、兼性性腺、精巢遞減,表明INAD基因可能在雌雄同體的斜帶石斑魚性逆轉(zhuǎn)過程發(fā)揮一定作用(圖5).

圖5 斜帶石斑魚INAD基因在卵巢、兼性性腺、精巢組織中的表達(dá)特異性

2.4 注射FSH或LH對斜帶石斑魚INAD基因在性腺中表達(dá)的影響

通過腹腔分別注射FSH和LH這兩種激素后,FSH組的15 d和30 d后性腺中INAD基因的表達(dá)量均低于對照組,LH組15 d和30 d后性腺中INAD基因的表達(dá)量均高于對照組,但均沒有發(fā)生顯著變化,斜帶石斑魚中FSH和LH兩種激素可能對INAD基因有影響,但可能沒有直接的調(diào)控作用(圖6).

圖6 斜帶石斑魚注射FSH和LH后INAD基因在性腺組織中的差異性表達(dá)

3 討論

本研究克隆了斜帶石斑魚INAD基因,ORF框長度為5 337 bp,INAD基因翻譯合成的是一種典型的支架蛋白,負(fù)責(zé)介導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)級聯(lián)視覺信號通路,調(diào)控視覺信號的傳導(dǎo),通過軟件預(yù)測其核心結(jié)構(gòu)由多個PDZ結(jié)構(gòu)域串聯(lián)組成.含PDZ 結(jié)構(gòu)域的蛋白多參與細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸離子通道、受體,以及相關(guān)信號傳導(dǎo)通路等多種生物學(xué)過程.最近的研究發(fā)現(xiàn)斜帶石斑魚性逆轉(zhuǎn)不僅受到季節(jié)的影響[11],也有可能受到社群控制誘導(dǎo)[12],社群控制誘導(dǎo)中的重要影響因素是視覺信號的傳導(dǎo).兩條雌性斜帶石斑魚在社會等級確立過程中會發(fā)生劇烈的打斗行為,在打斗過程中雙方體色會發(fā)生暫時性的變化,同時該顏色模式的出現(xiàn)也會引起群體內(nèi)其他個體的激烈反應(yīng),在參與打斗的魚中,優(yōu)勝者將會在幾周的時間內(nèi)發(fā)生性逆轉(zhuǎn),由雌性轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌訹13]231.在斜帶石斑魚社會等級確立的過程中發(fā)生打斗行為的雌魚視網(wǎng)膜中光轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路被激活,說明了視覺信號在社會等級確立及性逆轉(zhuǎn)的過程中起到重要作用[13]232,[14-15].一些研究報道,含有PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白在脊椎動物的性別決定和分化及配子形成過程中發(fā)揮著一定的功能.小鼠含有PDZ結(jié)構(gòu)域的SIP-1/NHERF2蛋白與SRY蛋白直接結(jié)合,在雄性決定過程中共定位于原支持細(xì)胞的細(xì)胞核中并可能發(fā)揮潛在的功能[16].還有研究報道,在黃鰭短須石首魚(Seriolaquinqueradiata)中,對性別決定位點(diǎn)連鎖的BAC進(jìn)行測序和連鎖分析,發(fā)現(xiàn)包含PDZ結(jié)構(gòu)域的GIPC蛋白可能會參與該石首魚的性別決定[17].

本研究通過腹腔分別注射FSH和LH這兩種激素后,檢測INAD基因在斜帶石斑魚性別的調(diào)控.FSH組的15 d和30 d后性腺中INAD基因的表達(dá)量均低于對照組,有研究發(fā)現(xiàn),FSH在斜帶石斑魚由雌性性逆轉(zhuǎn)為雄性和雄性轉(zhuǎn)變成雌性過程中均發(fā)揮重要的作用[18],但FSH的作用似乎與其濃度相關(guān),低劑量FSH注射激活雌性相關(guān)基因(例如cyp19a1a)的表達(dá),高劑量下卻抑制雌性相關(guān)基因的表達(dá),激活雄性相關(guān)基因的表達(dá),即誘導(dǎo)雄性命運(yùn)[19].LH組15 d和30 d后性腺中INAD基因的表達(dá)量均高于對照組,LH的主要作用可能是調(diào)控雌雄配子的發(fā)生與成熟.它可以誘導(dǎo)性腺合成和分泌與性腺成熟相關(guān)的性類固醇激素,以促進(jìn)卵母細(xì)胞和精子細(xì)胞的最后成熟以及排精排卵中起重要作用[20].可能由于注射的濃度及注射的持續(xù)時間長短的原因,FSH組和LH組與對照組相比INAD基因的表達(dá)量沒有顯著性差異.但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,在斜帶石斑魚中FSH和LH兩種激素對INAD基因的表達(dá)是有一定的調(diào)控作用.

本研究克隆鑒定了斜帶石斑魚INAD基因,對其cDNA進(jìn)行了序列分析和不同物種中的氨基酸序列同源性比對及進(jìn)化關(guān)系分析.初步探究了斜帶石斑魚INAD基因的表達(dá)與性腺發(fā)育過程中的功能,為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ).