顧峰源，蔣倩倩，姚自選，潘 艷，常思源

(南京科技職業(yè)學院，江蘇 南京 210048)

低聚木糖是由2～7個木糖分子以β-1,4糖苷鍵結(jié)合而形成的功能性低聚糖，是目前所有功能低聚糖中性能最穩(wěn)定、功能性最強、攝入量最少的益菌因子，其甜味純正，增值雙歧桿菌的功效是其他功能性寡糖類20倍以上。同時，難以被人體消化吸收，能量值幾乎為零。因此，低聚木糖在食品、醫(yī)藥和飼料等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。

玉米芯中木聚糖含量高達35%～40%，是制備低聚木糖的首選原料。目前，低聚木糖的工業(yè)化生產(chǎn)基本是采用木聚糖酶酶解玉米芯的方法。木聚糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，產(chǎn)生了大量的雜質(zhì)且組分復(fù)雜，所以在低聚木糖制品生產(chǎn)過程中，酶的純化和產(chǎn)品的精制是下游產(chǎn)品分離必不可少的步驟，這將會大大增加低聚木糖的生產(chǎn)成本。因此，簡化木聚糖酶純化以及產(chǎn)品精制的步驟是降低生產(chǎn)成本的有效手段。

酶吸附-催化耦合技術(shù)是近年來針對不溶性底物的酶催化反應(yīng)發(fā)展起來的一種新思路，即利用底物在酶發(fā)酵液中特異性的吸附目標酶，而后進行酶催化反應(yīng)。該耦合過程能有效降低目標酶的分離成本，易于產(chǎn)物有效分離，甚至能一步獲得高純度的產(chǎn)品，從而顯著降低產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。ZHANG等[3]將吸附-催化耦合技術(shù)用于N-乙酰氨基葡萄糖的生產(chǎn)，酶解殼聚糖的產(chǎn)率近100%，N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)品純度高達98%。然而，用于低聚木糖生產(chǎn)的木聚糖酶通常來自G11家族，由于缺少底物結(jié)合域，G11家族木聚糖酶難以緊密地吸附于底物木聚糖上。來自枯草芽孢桿菌的擴張蛋白(Expansin)與植物的擴張蛋白高度同源，不僅能夠松散木質(zhì)纖維素的天然結(jié)構(gòu)，還能夠緊密地吸附于木質(zhì)纖維素[4]。因此，在前期工作中，構(gòu)建了擴張蛋白-木聚糖酶的融合蛋白(EXLX:XYN)[5]。本研究對融合蛋白吸附和酶解玉米芯的條件進行優(yōu)化，以期對吸附-酶解耦合制備低聚木糖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器設(shè)備

融合蛋白生產(chǎn)工程大腸桿菌(E. coli BL21)為本實驗室前期構(gòu)建所得。木糖(X1)、木二糖(X2)、木三糖(X3)、木四糖(X4)以及木五糖(X5)購自Sigma公司。

恒溫培養(yǎng)箱(Biolog Microstation，system 4.2)、紫外分光光度計(UNICO，UV-2101C)、高速離心機(HITACHI，CR21G)、壓力蒸汽滅菌鍋(HIRAYAMA，HVE-50)、高效液相色譜(HPLC，DIONEX，UltiMate 3000)。

1.2 酶液制備

搖瓶LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L，初始pH值7.0。固體培養(yǎng)基再加入20 g/L的瓊脂。溫度121 ℃滅菌30 min。從抗性平板挑菌接種至10 mL液體培養(yǎng)基，溫度37 ℃，180 r/min培養(yǎng)過夜。然后按2%的接種量轉(zhuǎn)接至40 mL的三角瓶中。培養(yǎng)2 h后加入誘導(dǎo)劑40 μL，100 mmol/L IPTG。30 ℃誘導(dǎo)8 h后，菌液離心去上清，加等體積緩沖(pH值=6.5)重懸。重懸菌體經(jīng)超聲破碎后離心，破碎上清液即為粗酶液，4 ℃保存。酶活力測定：酶活力單位為每分鐘由底物產(chǎn)1 μmol還原糖所需的酶量定義為一個活力單位(U)[6]。

1.3 融合蛋白對玉米芯固體殘渣吸附

玉米芯預(yù)處理參照Aachary and Prapulla的堿預(yù)處理方法[7]。融合蛋白吸附反應(yīng)為20 mL體系，包含2 000 U的重組融合蛋白破碎上清粗酶液和適量的玉米芯于緩沖液中攪拌吸附。對吸附過程四個重要參數(shù)進行優(yōu)化，優(yōu)化參數(shù)為不同玉米芯濃度(1%、2%、5%、10%和20%)，pH值(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)，溫度(4、20、30、40、50 ℃)，時間(30、60、120、180、240 min)。吸附性能通過比較吸附反應(yīng)前后上清液中木聚糖酶活力，蛋白濃度和還原糖量的變化。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)表征融合蛋白對玉米芯的吸附效率。

1.4 吸附融合蛋白的玉米芯直接酶解工藝研究

吸附有融合蛋白的玉米芯進行直接酶解。對pH值(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)，溫度(30、40、50、60 ℃)，時間(12、24、36、48、60 h)等酶解條件進行優(yōu)化。酶解結(jié)束后立即煮沸10 min終止反應(yīng)，4 500 g離心30 min，上清液即為酶解液。測定酶解液中總糖含量和還原糖含量，分析低聚木糖得率和平均聚合度(DP)。通過薄層層析(TLC)和高效液相色譜(HPLC)對酶解液中低聚木糖組成和含量進行分析。

1.5 分析方法

1.5.1蛋白質(zhì)濃度測定

蛋白質(zhì)含量的測定參照Bradford法，以牛血清白蛋白(BSA)為標準蛋白繪制蛋白質(zhì)濃度標準曲線。

1.5.2還原糖含量測定

3,5-二硝基水楊酸法(DNS)測定酶解產(chǎn)物中的還原糖含量。

1.5.3總糖含量測定

取10 mL酶解液，加入10 mL體積分數(shù)8%的硫酸，混勻后煮沸2 h，待冷卻至室溫后用質(zhì)量分數(shù)20%的NaOH中和至pH值為7.0，定容至50 mL后用濾紙過濾，再用DNS法測定濾液中的還原糖含量。

1.5.4薄層層析條件

TLC所用展層劑為正丁醇∶乙酸∶水以3∶2∶1(體積比)混合，室溫下展層兩次，顯色劑為濃硫酸與乙醇以體積比1∶9混合，顯色溫度為120 ℃，時間5 min。

1.5.5HPLC色譜條件

HPLC分析檢測所用色譜柱為Kromasil NH2柱(Kromasil，Sweden)(250 mm×4.6 mm,5 μm)，進樣量20 μL，視差檢測器，流動相為乙腈∶水=75∶25，流速0.7 mL/min。

計算公式如下：

平均聚合度(DP)=酶解液中總糖含量/酶解液中還原糖含量。

低聚木糖得率(%)=酶解液中總糖含量/底物木聚糖含量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物濃度對融合蛋白吸附性能的影響

在吸附溫度4 ℃、pH值6.0、時間60 min 的條件下，分別選取底物濃度為1%、2%、5%、10%和20%進行融合蛋白吸附實驗。如圖1所示，融合蛋白在底物濃度較低(1%～2%)時，吸附量較少。隨著底物濃度的提高(5%～20%)，融合蛋白吸附的木聚糖酶活性從64.9 U/mL增加至69.6 U/mL，吸附的蛋白濃度從0.084 g/L增加至0.129 g/L。另一方面，木聚糖酶比酶活卻在下降，這說明提高底物濃度造成了雜蛋白吸附在玉米芯上，導(dǎo)致木聚糖酶比酶活下降。因此，5%是融合蛋白吸附最佳的底物濃度。

圖1 底物濃度對融合蛋白吸附性能

2.2 吸附pH值對融合蛋白吸附性能影響

在吸附溫度4 ℃、時間60 min、底物濃度5%條件下，分別選取吸附pH值5.0、6.0、7.0、8.0和9.0進行融合蛋白吸附研究。如圖2所示，當pH值為7.0時，融合蛋白具有最佳的吸附能力(木聚糖酶活性78.8×103U/L和蛋白質(zhì)濃度0.088 g/L)。融合蛋白的吸附能力在pH值為5.0(48.8 U/mL，0.072g/L)條件下要小于pH值9.0(72.8 U/mL，0.086g/L)。這一結(jié)果表明，融合蛋白更適合在弱堿性條件下進行吸附。LIN等[8]報道在pH值7.0條件下，EXLX1具有最優(yōu)的吸附能力。同時，也有一些報道發(fā)現(xiàn)Expansin在pH值4.8以及pH值5.5時具有最佳吸附效果[9]。這些結(jié)果表明，來源不同的Expansin可能具有不同的吸附特性。

圖2 吸附pH值對融合蛋白吸附性能影響

2.3 吸附溫度對融合蛋白吸附性能影響

在吸附pH值7.0、時間60 min、底物濃度5%的條件下，分別選取吸附溫度4、20、30、40、50 ℃進行融合蛋白吸附實驗。如圖3所示，隨著溫度的升高，吸附的蛋白濃度和木聚糖酶活性分別從0.086 g/L上升至0.101 g/L，以及78.6 U/mL至93.1 U/mL。另一方面，隨著溫度從20 ℃至50 ℃時，吸附體系中還原糖的量從0.2 mg增加至0.9 mg。還原糖的產(chǎn)生說明隨著溫度上升，玉米芯殘渣已被降解，這將會影響后期低聚木糖產(chǎn)量。因此，融合蛋白最佳吸附溫度為20 ℃，此時融合蛋白的吸附效率較高，還原糖的產(chǎn)量較低。

圖3 吸附溫度對融合蛋白吸附性能影響

2.4 吸附時間對融合蛋白吸附性能影響

在吸附pH值7.0、溫度20 ℃、底物濃度5%的條件下，分別以吸附時間30、60、120、180、240 min進行融合蛋白吸附實驗。如圖4所示，在30 min之內(nèi)，大部分的融合蛋白(90.3 U/mL)吸附在玉米芯上；當吸附120 min后，融合蛋白吸附的木聚糖酶活力最大(95.9 U/mL)。然而，吸附的蛋白濃度也隨著時間的增加而增加，120 min時融合蛋白木聚糖酶比酶活(928.5 U/mg)小于30 min時(987.6U/mg)。結(jié)果表明，延長吸附時間更有利于雜蛋白的吸附。因此，30 min為融合蛋白最佳吸附時間。

圖4 吸附時間對融合蛋白吸附性能影響

SDS-PAGE分析顯示，大量的融合蛋白(90.3%)吸附在玉米芯上，而木聚糖酶XYN則只有13.5%的蛋白保留在玉米芯上，并且大部分蛋白易被清洗液洗脫)。結(jié)果表明，添加了擴張蛋白的木聚糖酶能夠有效地吸附在玉米芯上。這將有利于融合蛋白從粗酶液中快速地獲取，而后直接用于低聚木糖的生產(chǎn)，簡化生產(chǎn)步驟。

2.5 酶解pH值對低聚木糖得率的影響

采用底物濃度5%、酶解溫度40 ℃、時間24 h，考察不同pH值對酶解效率的影響，結(jié)果見圖5。pH值是影響木聚糖酶酶活的關(guān)鍵因子，當反應(yīng)體系的pH值大于8.0或小于6.0時，酶活力下降很快，酶解產(chǎn)物的平均聚合度較大，低聚木糖得率較低。當反應(yīng)體系的pH值在6.0～8.0時，低聚木糖得率均到達60%以上，在木聚糖酶的最適pH值7.0時達到最高，低聚木糖得率為61.2%，平均聚合度為3.61。

圖5 酶解pH值對低聚木糖得率的影響

2.6 酶解溫度對低聚木糖得率的影響

在底物濃度5%、酶解pH值7.0、時間24 h的條件下，考察不同溫度對酶解效率的影響，結(jié)果見圖6。低聚木糖得率隨著酶解溫度的升高而迅速增加，在50 ℃時到達最大值60%，隨后低聚木糖得率急劇下降。這可能是由于溫度低于酶最適反應(yīng)溫度時，融合蛋白木聚糖酶活性受到抑制，酶解速率較低，造成得率較低。而過高的反應(yīng)溫度提高了酶解速率，同時也提高了酶熱失活速率。因此，最適酶解溫度為50 ℃。

圖6 酶解溫度對低聚木糖得率的影響

2.7 酶解時間對低聚木糖得率的影響

在最佳條件下研究酶解的進程曲線，結(jié)果如圖7所示。

圖7 酶解時間對低聚木糖得率的影響

低聚木糖得率隨反應(yīng)時間的延長而逐漸提高，在0～12 h時，低聚木糖得率提升緩慢，12～24 h低聚木糖得率迅速提高，24 h低聚木糖得率達到35%，24 h之后逐漸趨于平緩。這可能是由于初始12 h融合蛋白作用于不可溶玉米芯殘渣，破壞玉米芯的固有結(jié)構(gòu)，釋放更多的木聚糖組分，酶解效率相對較低；12 h后融合蛋白作用于木聚糖組分，生成短鏈聚合物。因此，24 h為最適的酶解時間。

2.8 酶解產(chǎn)物的表征

在底物濃度5%、pH值7.0、溫度50 ℃和酶解時間24 h的最佳條件下進行酶解反應(yīng)，以TLC和HPLC對酶解產(chǎn)物進行分析。TLC結(jié)果顯示酶解產(chǎn)物包含木二糖、木三糖、木四糖和木五糖等低聚木糖，且沒有單糖的產(chǎn)生。

酶解產(chǎn)物中木二糖和木三糖分別占總量的45.2%和36.7%。這些結(jié)果表明，融合蛋白具有作為低聚木糖生產(chǎn)酶的能力，并且酶解產(chǎn)物無需繁復(fù)的精制過程，即可達到低聚木糖產(chǎn)品要求。

3 結(jié)論

本研究旨在優(yōu)化融合蛋白吸附-催化耦合體系，首先考察了玉米芯固體殘渣的添加量、吸附溫度、吸附pH值、吸附時間等主要吸附影響因素對該吸附體系的影響，以上清木聚糖酶活力的減少量和蛋白的減少量為檢測方法，最佳的玉米芯固體殘渣的添加量5%、吸附溫度20 ℃、吸附pH值7.0、吸附時間30 min，最終90.3%的融合蛋白吸附于玉米芯固體殘渣上，并且通過掃描電鏡和SDS-PAGE表征吸附效果。其次，考察了玉米芯固體殘渣與融合蛋白復(fù)合物的添加量、酶解溫度、酶解pH值、酶解時間等主要酶解影響因素對該酶解過程的影響，以低聚木糖為目標產(chǎn)物，當?shù)孜餄舛葹?%，最佳的酶解溫度50 ℃、pH值7.0、時間24 h，最終低聚木糖得率為47.7%，平均聚合度為2.3。TLC和HPLC分析結(jié)果顯示，酶解產(chǎn)物主要為木二糖和木三糖，且占總量的80%以上。本研究不僅將為新型吸附-催化耦合產(chǎn)生低聚木糖技術(shù)提供依據(jù)，而且還為其他低聚糖制備提供方法學借鑒。