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大皰性類天皰瘡患者皮損和血清中MMP-2的表達

2020-11-06 07:47張海祥秦蘭英石曉旭趙子申葉文靜劉婕李丙南曹娜張群
關(guān)鍵詞:天皰瘡胞外基質(zhì)表皮

張海祥,秦蘭英,石曉旭,趙子申,葉文靜,劉婕,李丙南,曹娜,張群

(滄州市人民醫(yī)院,河北滄州061000)

目前據(jù)國外研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)在許多大皰類皮膚病的皮損中均有陽性表達或發(fā)揮著重要作用。如:在家族性良性慢性天皰瘡中角質(zhì)形成或分離細胞周圍的細胞中MMP-9被陽性染色;MMP-12在尋常型天皰瘡皮損和大皰性類天皰瘡皮損中均檢測到;MMP-9可能參與尋常型天皰瘡的棘層松解[1-4]。大皰性類天皰瘡(Bullous pemphigoid,BP)是一種獲得性自身免疫性大皰類皮膚病[5]。目前認為抗BP180的抗體是主要的致病抗體,抗BP180抗體通過補體激活、中性粒細胞募集和蛋白酶的釋放,破壞半橋粒和細胞外基質(zhì)成分,在基底層的透明板內(nèi)發(fā)生真表皮的分離,引起表皮下水皰。MMP-2又稱白明膠酶A,能降解明膠和Ⅳ型膠原纖維,二者是基底膜的主要組成成份[6-7];也能降解其他基質(zhì)蛋白:Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ型膠原、核心蛋白聚糖、彈力蛋白和纖維連接蛋白等[5,8-10]。真皮和表皮的分離必然伴隨著細胞基質(zhì)的降解,提示MMP-2可能在BP的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。因此,筆者檢測了MMP-2在BP皮損和血清中的表達,從而進一步探討MMP-2在BP發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例與標本 24例BP患者的皮損和血清,女 10例,男14例。年齡 44~87歲,平均(67.4±15.0)歲;均來自滄州市人民醫(yī)院皮膚科,經(jīng)臨床、組織病理、直接免疫熒光、間接免疫熒光確診為BP,且均未接受過治療。正常對照組15例,女7例,男8例,年齡28~81歲,平均(59.9±13.6)歲,均為滄州市人民醫(yī)院整形外科非免疫皮膚病患者,均為健康志愿者。

1.1.2 試劑 鼠抗人MMP-2單克隆抗體(美國R&D);山羊抗鼠IgG的SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);人MMP-2酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法試劑盒(R&D)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化學(xué)染色 所有皮膚標本經(jīng)10%中性甲醛常規(guī)固定、石蠟包埋,制成4 μm厚連續(xù)切片;將切片置于60℃烤箱烘烤;脫蠟水化;磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,0.1%的檸檬酸鈉溶液中高壓熱修復(fù);PBS沖洗,滴加3%的過氧化氫去離子水;PBS沖洗,滴加一抗(鼠抗人MMP-2單克隆抗體)過夜;PBS浸洗,滴加生物素標記的IgG工作液;PBS浸洗,滴加辣根過氧化酶標記的鏈霉卵白素工作液;PBS浸洗,滴加DAB辣根過氧化物酶顯色試劑顯色,復(fù)染;封片后鏡下觀察并掃描,圖像分析,拍照。嚴格按Sp試劑盒操作說明操作。真表皮交界處細胞被染成棕黃色為陽性,正常皮膚無著色或著色不明顯。染色結(jié)果分析:高倍鏡(40×10)下用網(wǎng)形目鏡測微尺單盲法計數(shù)5個視野的陽性細胞的均數(shù)。所有操作均有同1名實驗者判斷。

1.2.2 ELISA 加100 μL試驗稀釋劑 RD1-34到每個孔里;向各孔加100 μL標準品、對照或樣本,放在搖板上孵育2 h;沖洗4次,向各孔加200 μL二抗,放在搖板上孵育1 h;沖洗4次,向各孔加200 μL 染色液,放置 30 min,避光;向各孔加 50 μL終止液;450 nm波長下檢測,并建立標準曲線,取得MMP-2的血清濃度。嚴格按ELISA試劑盒操作說明操作。通過酶標儀讀取結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計。先行方差齊性檢驗,然后正常組和對照組之間應(yīng)用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義;兩變量之間的相互關(guān)系用Pearson相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色 MMP-2在BP患者皮損中主要表達于皮膚的表皮層,真皮層的炎性細胞也有少量表達,在皰液中也有明顯表達,呈棕黃色顆粒狀;在對照組的皮膚組織中MMP-2也有較弱表達,見圖1。在高倍鏡(40×10)的視野內(nèi),BP患者皮損中MMP-2的表達較對照組顯著增加,BP皮損與正常人皮膚MMP-2的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.95,P<0.01),見表 1。

表1 MMP-2在BP患者皮損與正常對照組皮膚中的表達[每高倍鏡(40×10)視野的陽性細胞數(shù)]

2.2 ELISA 24例BP患者血清和24例對照組血清經(jīng)ELISA實驗,通過酶標儀讀取結(jié)果,結(jié)果顯示血清MMP-2的平均水平在BP患者組為(38.54±23.00)ng/mL,在正常對照組為(17.51±5.45)ng/mL。BP組顯著高于正常對照組,2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.36,P<0.01),見表 2。

表2 MMP-2在BP患者組與正常對照組血清中的分泌水平 (ng/mL,±s)

表2 MMP-2在BP患者組與正常對照組血清中的分泌水平 (ng/mL,±s)

組別 n images/BZ_8_459_1343_481_1387.png±s P BP 組 24 38.54±23.00 0.05對照組 15 17.51±5.45

2.3 比較同1例BP患者皮損中表達MMP-2的細胞數(shù)目和血清中MMP-2的分泌水平,統(tǒng)計學(xué)方法為Pearson相關(guān),結(jié)果顯示二者之間無明顯的相關(guān)性(γ=0.005,P=0.982)。

圖1 免疫組化染色結(jié)果:MMP-2的表達情況(DAB 染色×400)

3 討論

目前據(jù)國外研究表明BP的發(fā)病機制與基底膜組份的破壞有關(guān)。自身抗體結(jié)合表皮基底膜的抗原,激活補體和水解酶等,導(dǎo)致水皰的形成。一些研究已經(jīng)表明MMP參與了BP的皮損的發(fā)生,然而在具體過程中的作用尚不清楚[5]。MMP-2和MMP-9被檢測到在表皮、基底層角質(zhì)形成細胞和水皰部位均有表達[11]。有報道表明表皮與真皮分離發(fā)生在基底層,伴隨著大量的炎性滲出物和半橋粒及細胞外基質(zhì)成分的降解,炎性細胞的蛋白水解酶參與了BP水皰的形成,較高水平的蛋白水解酶,包括MMP-2、MMP-9等已經(jīng)被檢測到在BP的皰液中和皮損中表達[12]。

MMP是一族鋅依賴性內(nèi)肽酶,可降解細胞外基質(zhì)中各種蛋白成分,基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)能特異性抑制其活性。二者是細胞外基質(zhì)合成及代謝平衡中2個重要的酶系,參與多種與細胞外基質(zhì)蛋白水解重塑有關(guān)的生理過程,如組織發(fā)生、組織修復(fù)、血管形成等。多種細胞因子、細胞外基質(zhì)成分、致癌物、原癌基因產(chǎn)物如表皮生長因子(EGF)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、血小板衍生生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、白細胞介素(IL)-1、c-fos和c-jun的表達產(chǎn)物能促進多種MMP mRNA的轉(zhuǎn)錄[13]。

MMP-2是MMPs家族中的重要成員,也是發(fā)現(xiàn)較早的因子,又稱明膠酶或Ⅳ型膠原酶,是臨床最重要的明膠酶之一。MMP-2基因位于人類染色體6q21,由13個外顯子和12個內(nèi)含子組成,其結(jié)構(gòu)基因總長度為27 KB,相對分子質(zhì)量為72 kD。MMP-2可由體內(nèi)多種細胞合成和分泌,包括成角質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、纖維細胞及軟骨細胞等。但MMP-2無活性,以ProMMP-2的形式分泌,經(jīng)過水解后才被激活。MMP-14與TIMP-2協(xié)同作用催化MMP-2成為活性形式[14]。

本研究結(jié)果顯示BP患者皮損和血清中MMP-2的表達均明顯增加,提示MMP-2可能在BP的發(fā)病機制中起重要作用。但MMP-2的變化是否有診斷和治療上的指導(dǎo)意義暫時還不確定。BP患者皮損和血清中MMP-2高表達的機制可能與BP180在基底膜帶介導(dǎo)抗原抗體反應(yīng)有關(guān)。在補體和炎性反應(yīng)的刺激下,導(dǎo)致MMP mRNA的轉(zhuǎn)錄增加,進一步促進ProMMP-2合成,合成增多的ProMMP-2繼而被水解激活,導(dǎo)致MMP-2的高表達,而高表達的MMP-2可以降解明膠和Ⅳ型膠原纖維等基質(zhì)蛋白,從而可能使表皮和真皮在基底帶發(fā)生分離,導(dǎo)致表皮下水皰的形成。此外根據(jù)試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),在同1例患者的血清和皮損中MMP-2的表達無明顯的相關(guān)性,考慮可能與疾病的發(fā)展階段,病情的輕重及皮損取材部位有一定關(guān)系。

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