李鎖 李志量 荊可 向睿宇 張寒梅 馮素英 林麟

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院皮膚科 江蘇省皮膚病與性病學(xué)重點實驗室，南京 210042

天皰瘡是一種嚴(yán)重的自身免疫性表皮內(nèi)水皰病，可導(dǎo)致皮膚和/或黏膜出現(xiàn)松弛性水皰和糜爛面，并可造成嚴(yán)重的低蛋白血癥、感染甚至敗血癥。天皰瘡發(fā)病機制尚不清楚，目前認(rèn)為橋粒芯糖蛋白1（Dsg1）和Dsg3 抗體在誘發(fā)天皰瘡水皰形成中起了主要作用，并為橋粒芯糖蛋白的“補償學(xué)說”提供了理論基礎(chǔ)［1］。目前天皰瘡主要治療藥物仍為糖皮質(zhì)激素，在治療早期可根據(jù)皮損面積和新發(fā)皮損或天皰瘡疾病面積指數(shù)調(diào)整糖皮質(zhì)激素劑量，然而在緩解期大部分患者皮損基本愈合，因此尋找一個客觀可靠的指標(biāo)來監(jiān)測病情及指導(dǎo)藥物調(diào)整尤其在臨床緩解期顯得十分重要。目前有不少文獻報道Dsg1抗體和Dsg3抗體與臨床表型和疾病嚴(yán)重程度和活動度相關(guān)［2-3］，然而大部分臨床研究樣本量偏少且隨訪時間短，不能夠很好地反應(yīng)Dsg1和Dsg3 抗體變化規(guī)律。為此，我們檢測天皰瘡患者相關(guān)抗體，探討Dsg1 和Dsg3 抗體與天皰瘡臨床表型和疾病活動度關(guān)系及變化規(guī)律，從而更好地指導(dǎo)皰病血清學(xué)診斷和病情監(jiān)測在天皰瘡中的應(yīng)用。

病例與方法

一、病例

2015年1月至2018年1月在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院就診的111 例天皰瘡患者，男61 例，女 50 例，年齡 19～ 87 歲，平均年齡 49.53 歲。按照臨床表型分類，落葉型天皰瘡43 例，男21 例，女22 例，平均年齡50.95 歲；黏膜型尋常型天皰瘡10 例，男 6 例，女 4 例，平均年齡 49.7 歲；黏膜皮膚型尋常型天皰瘡58 例，男34 例，女24 例，平均年齡48.62 歲。

入選標(biāo)準(zhǔn)：①皮膚和（或）黏膜出現(xiàn)松弛性水皰，尼氏征陽性；②組織病理可見棘層松解細(xì)胞；③直接免疫熒光可見角質(zhì)形成細(xì)胞間IgG和/或C3沉積；④Dsg1和/或Dsg3 ELISA值 ＞20 U/ml。其中天皰瘡診斷符合①+②+③或④；或者①+②或③或④，但需排除其他棘層松解性疾病如毛囊角化病、家族性良性慢性天皰瘡和一過性棘層松解性皮病等［4-5］。本研究通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)［批準(zhǔn)號：（2016）快審第（KY004）號］，患者均簽署知情同意書。

初發(fā)定義為患者發(fā)病首次就診，未系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素及細(xì)胞毒藥物；控制階段為至少2周內(nèi)沒有新發(fā)的紅斑和水皰，原有的水皰和糜爛面開始消失；糖皮質(zhì)激素維持治療階段為口服糖皮質(zhì)激素（相當(dāng)于潑尼松）＜15 mg/d，且病情穩(wěn)定1個月及以上；病情復(fù)發(fā)為皮膚和黏膜出現(xiàn)≥3處新發(fā)的紅斑和/或水皰或者原有水皰和/或糜爛面向外擴展，且使用原糖皮質(zhì)激素量1周內(nèi)不能自發(fā)愈合［2，4］。

二、ELISA定量

111例天皰瘡患者中，初發(fā)時、控制階段、維持階段分別有 92 例、53 例、33 例患者進行 ELISA 檢測，9 例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)后進行ELISA 檢測。按照Dsg1和Dsg3抗體檢測試劑盒（日本MBL公司）說明書操作。將待測血清（1∶101稀釋）及Calibrator1和Calibrator2 各100 μl 分別加入至抗原包被的微孔，室溫孵育1 h，洗滌4次；各孔加入100 μl結(jié)合液，室溫孵育1 h，洗滌4次；各孔加入100 μl底物溶液，室溫孵育30 min；各孔加入100 μl 終止液終止酶反應(yīng)。酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）450 nm下讀取每孔吸光度（A值），根據(jù)結(jié)果判定公式計算Dsg1、Dsg3水平，抗體水平（U/ml）=（A450樣本-A450Calibrator1）/（A450Calibrator2-A450Calibrator1）× 100，每個樣品 2 個復(fù)孔，取平均值。結(jié)果判定：Dsg1、Dsg3 抗體水平＜20 U/ml為陰性，＞20 U/ml為陽性。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、天皰瘡患者Dsg1和Dsg3抗體檢測結(jié)果

43 例落葉型天皰瘡患者中，36 例初發(fā)時檢測Dsg1 和 Dsg3 抗體水平，ELISA 值陽性率分別為100%、2.77%；10 例黏膜型尋常型天皰瘡分別為20%、80%；58 例黏膜皮膚型尋常型天皰瘡中46 例初發(fā)時檢測 Dsg1 和 Dsg3 抗體水平，ELISA 值陽性率分別為97.82%、95.65%（表1）。

表1 天皰瘡患者初發(fā)時酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測橋粒芯糖蛋白1（Dsg1）和Dsg3抗體結(jié)果 例

二、Dsg1和Dsg3抗體與臨床活動度的關(guān)系

與初發(fā)和復(fù)發(fā)時相比，控制和維持階段Dsg ELISA 值明顯下降（P＜ 0.01）；9 例出現(xiàn)復(fù)發(fā)的患者，Dsg ELISA指數(shù)明顯上升。見表2。4例黏膜皮膚型尋常型天皰瘡患者初發(fā)時及Dsg ELISA 多點檢測發(fā)現(xiàn)，Dsg1 抗體水平較Dsg3 抗體水平更易下降。見圖1。

三、患者表位擴展現(xiàn)象

111 例天皰瘡患者在治療過程中，有2 例女性患者出現(xiàn)表位擴展?；颊?，50 歲，初發(fā)時臨床表型為落葉型天皰瘡，Dsg1、Dsg3抗體滴度分別為36 U/ml、0；20個月后口腔出現(xiàn)水皰和糜爛，Dsg1、Dsg3抗體滴度分別為102、105 U/ml?；颊?，54歲，初發(fā)時臨床表型為黏膜皮膚型尋常型天皰瘡，Dsg1、Dsg3 抗體滴度分別為 142 U/ml、0；發(fā)病 19 個月后滴度分別為173、164 U/ml（圖2）。

四、病情穩(wěn)定期Dsg1和Dsg3抗體高滴度分析

4例患者在病情穩(wěn)定期發(fā)生Dsg抗體高滴度現(xiàn)象，其中1例為落葉型天皰瘡，3例為皮膚黏膜型尋常型天皰瘡（圖3）。4 例患者在開始發(fā)病1 個月至半年內(nèi)抗體滴度隨著疾病得到有效控制逐漸下降并轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮?，半年?年后抗體滴度逐漸升高并維持在高滴度水平而病情平穩(wěn)，糖皮質(zhì)激素減量時天皰瘡病情并未發(fā)生波動。

討 論

1964年Beutner 和 Jordon［6］發(fā)現(xiàn)尋常型天皰瘡患者血清存在能夠和表皮細(xì)胞表面抗原結(jié)合的循環(huán)抗體，開啟了天皰瘡靶抗原的研究。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的進步，證實了天皰瘡主要靶抗原為Dsg1 和Dsg3，并通過免疫熒光和免疫組化發(fā)現(xiàn)Dsg1 和Dsg3 在皮膚和黏膜的分布位置不同，進而發(fā)展了橋粒芯糖蛋白的“補償學(xué)說”［1］，將天皰瘡大致分為落葉型天皰瘡（Dsg1 抗體陽性），黏膜型尋常型天皰瘡（Dsg3抗體陽性）和黏膜皮膚型尋常型天皰瘡（Dsg1和Dsg3抗體陽性）。目前有不少文獻已報道Dsg1 抗體和Dsg3 抗體與天皰瘡臨床表型、疾病嚴(yán)重程度、活動度相關(guān)［2-3，7-11］，但大部分臨床研究樣本量偏小，不能夠很好反應(yīng)Dsg1、Dsg3抗體規(guī)律。目前天皰瘡主要治療藥物仍為糖皮質(zhì)激素，大部分天皰瘡患者臨床緩解期時皮損基本愈合，因此尋找一個客觀可靠的指標(biāo)來監(jiān)測病情及指導(dǎo)藥物調(diào)整顯得十分重要。本研究對111 例天皰瘡患者進行相關(guān)抗體檢測，探討Dsg1 和Dsg3 抗體與天皰瘡臨床表型和疾病活動度關(guān)系及變化規(guī)律，從而更好地指導(dǎo)皰病血清學(xué)診斷和病情監(jiān)測在天皰瘡中的應(yīng)用。

表2 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測天皰瘡患者初發(fā)時及治療后不同階段橋粒芯糖蛋白l（Dsg1）和Dsg3抗體水平（U/ml±s）

表2 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測天皰瘡患者初發(fā)時及治療后不同階段橋粒芯糖蛋白l（Dsg1）和Dsg3抗體水平（U/ml±s）

注：a 與初發(fā)時比較，P ＜ 0.05；b 與復(fù)發(fā)時比較，P ＜ 0.05

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圖1 4例黏膜皮膚型尋常型天皰瘡患者初發(fā)時及治療期間橋粒芯糖蛋白l（Dsg1）和Dsg3抗體多點檢測水平（U/ml）

圖2 2例出現(xiàn)表位擴展現(xiàn)象的天皰瘡患者橋粒芯糖蛋白l（Dsg1）和Dsg3抗體滴度變化情況（U/ml）

圖3 4例穩(wěn)定期天皰瘡患者發(fā)生橋粒芯糖蛋白抗體（Dsg1、Dsg3）高滴度現(xiàn)象（U/ml）患者1為落葉型天皰瘡患者，患者2～4為黏膜皮膚型尋常型天皰瘡患者

通過天皰瘡臨床表現(xiàn)和Dsg 抗體類型相關(guān)性研究，逐步發(fā)展為橋粒芯糖蛋白補償學(xué)說：即當(dāng)Dsg1 和Dsg3 共同表達于同一細(xì)胞時，他們將互相補償對方自身或者抗體所致的功能不足［1］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，落葉型天皰瘡、黏膜型尋常型天皰瘡和黏膜皮膚型尋常型天皰瘡患者符合率分別為35/36、8/10和43/46，說明其他次要抗原和表位擴展等因素參與天皰瘡的發(fā)病，但橋粒芯糖蛋白抗體作為主要致病抗體參與天皰瘡發(fā)?。?2-16］。同時我們發(fā)現(xiàn)2 例黏膜型尋常型天皰瘡患者Dsg1 抗體陽性而Dsg3抗體陰性，Kogi曾報道5例類似患者［17］。目前對黏膜型尋常型天皰瘡出現(xiàn)Dsg1抗體的現(xiàn)象尚未闡明，發(fā)生該現(xiàn)象可能有，抗Dsg1抗體與Dsg3有交叉反應(yīng)；可能存在其他因素參與黏膜型尋常型天皰瘡的發(fā)?。籇sg1 特殊靶位參與黏膜型尋常型天皰瘡的發(fā)??；可能是副腫瘤性天皰瘡患者合并Dsg1 抗體（本文2 例患者隨訪時間已有2年，可排除副腫瘤性天皰瘡的可能）。

與初發(fā)和復(fù)發(fā)時相比，控制和維持治療階段Dsg 抗體水平明顯下降，同時發(fā)現(xiàn)皮膚黏膜型尋常型天皰瘡初次治療期間Dsg1抗體水平較Dsg3抗體水平更易下降。Dsg1 和Dsg3 抗體均可引起P38MAPK活化及角蛋白回縮，最終導(dǎo)致細(xì)胞解離，而Dsg1抗體和Dsg3抗體介導(dǎo)的具體信號傳導(dǎo)途徑目前發(fā)現(xiàn)存在差異：Dsg3 抗體更易活化Src，而Dsg1抗體更易導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流和ERK活化［9，18］。結(jié)合我們的臨床研究，Dsg1 抗體和Dsg3 抗體介導(dǎo)的具體信號傳導(dǎo)途徑研究有可能會揭示不同類型天皰瘡治療異質(zhì)性的具體機制，并實現(xiàn)天皰瘡精準(zhǔn)化治療。

在Dsg 抗體水平監(jiān)測過程中，我們發(fā)現(xiàn)4 例患者出現(xiàn)病情穩(wěn)定期Dsg 抗體高滴度現(xiàn)象。其特點為Dsg 抗體滴度隨著疾病得到有效控制逐漸下降并轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮?，半年?年后抗體滴度逐漸升高并維持在高滴度水平而天皰瘡病情平穩(wěn)，且糖皮質(zhì)激素按計劃減量時病情并未發(fā)生波動。Dsg 抗體高滴度現(xiàn)象一直困擾著臨床工作者和相關(guān)科研人員，有多種解釋假說［2］，由于天皰瘡是由多克隆自身反應(yīng)性B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，因此可能在疾病治療過程中，隨著致病性自身反應(yīng)性B細(xì)胞被清除，而非致病性自身反應(yīng)性B細(xì)胞由于各種原因免被清除，從而導(dǎo)致Dsg抗體高滴度而病情穩(wěn)定的現(xiàn)象，其他解釋還有Dsg抗體發(fā)生了亞類轉(zhuǎn)換或機體對Dsg抗體產(chǎn)生免疫耐受。

本次研究表明，Dsg 抗體譜與天皰瘡臨床表型有關(guān)，其Dsg ELISA 值和天皰瘡患者疾病活動度相關(guān)，可用于監(jiān)測疾病活動，并可對治療的有效性作出評價。部分患者可出現(xiàn)病情穩(wěn)定期Dsg 抗體高滴度現(xiàn)象，在調(diào)整糖皮質(zhì)激素劑量時我們應(yīng)當(dāng)結(jié)合臨床制定相關(guān)治療方案。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突