王永娟，郭艷麗，崔平福，張紫菡，陳梓岳，陸 輝，朱善元*

（1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300；2. 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210000；3. 泰州海關(guān)，江蘇 泰州 225300）

干擾素（Interferon，IFN）是干擾病毒復(fù)制的細(xì)胞因子[1]，IFN-γ 為IFN-II[2]，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能[3]。早期干擾素的制備采用生物提取法，優(yōu)點(diǎn)是天然、生物活性較高，但具有成本高、生產(chǎn)規(guī)模小、效率低等缺點(diǎn)[4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，現(xiàn)多采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)IFN。與生物提取法相比，重組IFN 具有純度高、成本低、便于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，目前已有其基因工程產(chǎn)品應(yīng)用于臨床疾病治療和疫苗的免疫佐劑[5-6]。

近年來，部分水禽病毒性疾病仍缺乏有效的治療手段，病毒性疾病嚴(yán)重困擾并制約著水禽產(chǎn)業(yè)體系的健康發(fā)展[7]。如果大量使用化學(xué)藥物容易造成耐藥性，甚至由于在體內(nèi)殘留會(huì)威脅人類的健康。而IFN 是具有強(qiáng)大生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，其廣譜的抗病毒作用尤為突出，IFN 在抗病毒方面的應(yīng)用積極響應(yīng)了“減抗替抗，綠色用藥”的號(hào)召，具有廣闊的應(yīng)用前景，因此研發(fā)廣譜、高效、安全的重組禽類IFN 尤為重要?；诖?，本研究構(gòu)建并表達(dá)重組類彈性多肽蛋白-鴨INF-γ（ELP-DuIFNγ），并分析其在體內(nèi)外的抗病毒活性，為重組鴨γ-干擾素（DuIFNγ）制劑研發(fā)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步臨床試驗(yàn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料限制性內(nèi)切酶Sac I 和Xho I、Taq DNA 聚合酶購自Thermo Fisher Scientific 公司；T4 DNA 連接酶、1kb DNA Marker、Prestained Protein分子量Marker 均購自Fermentas 公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自TaKaRa 公司；膠回收試劑盒、SDSPAGE 電泳試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、包涵體純化試劑盒、大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞均購自康為世紀(jì)公司；FM 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

pET30a-ELP 載體和水皰性口炎病毒（VSV）由揚(yáng)州大學(xué)孫懷昌教授惠贈(zèng)；鴨成纖維細(xì)胞（DEF）和犬腎細(xì)胞（MDCK）由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；I 型鴨肝炎病毒（DHAV-1）由中國農(nóng)科院上海獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；1 日齡的櫻桃谷鴨購自泰興市嘉益畜禽養(yǎng)殖有限公司。

1.2 DuIFNγ基因序列的設(shè)計(jì)合成由于鴨IFN 序列相對(duì)保守，在設(shè)計(jì)DuIFNγ 基因序列時(shí)依據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛性，參考GenBank 已經(jīng)發(fā)表的Du-IFNγ（DQ855272）進(jìn)行序列優(yōu)化，并在其兩端引入酶切位點(diǎn)BamH I 和Nde I，目的基因由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，并與pUC57 載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC57-DuIFNγ。

1.3 引物設(shè)計(jì)合成及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建對(duì)pET30a-ELP 載體序列的酶切位點(diǎn)分析，設(shè)計(jì)1 對(duì)引物：TAGAGCTCCGGCGCGCCGTGCTCTGGTTCTGCTC TGTT（Sac I）/CACTCGAGTTAGCAACGGCAACGTTTC GGAG（Xho I），引物由生工生物工程（北京）股份有限公司合成。以pUC57-DuIFNγ 為模板，PCR 擴(kuò)增DuIFNγ 基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Sac I 和Xho I 雙酶切后利用T4 連接酶與pET30a-ELP 載體連接，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)Sac I/Xho I 酶切鑒定，鑒定正確的陽性質(zhì)粒由生工生物工程（北京）股份有限公司測(cè)序鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET30a-ELP-Du-IFNγ。

1.4 重組ELP-DuIFNγ蛋白質(zhì)粒（rELP-DuIFNγ）的表達(dá)與純化將重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-ELP-Du-IFNγ 和空載體pET30a-ELP 分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落過夜活化，然后轉(zhuǎn)接種至2×YT 培養(yǎng)基，180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)約2 h 至菌液OD600nm為0.6，加入終濃度1 mmol/L 的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，收集菌體，低溫條件下超聲破碎細(xì)菌，煮沸變性后經(jīng)8%的SDS-PAGE 檢測(cè)rELP-DuIFNγ 的表達(dá)。

收集上述裂解后的菌液12 000 r/min 離心15 min分離上清液，加入等體積的NaCl 溶液，使鹽離子終濃度為3 mol/L，28 ℃水浴孵育10 min，鹽離子處理后的混合液在28 ℃下12 000 r/min 離心15 min，棄上清，沉淀即為初步純化的rELP-DuIFNγ。用預(yù)冷的PBS 重懸析出的重組蛋白，經(jīng)8%的SDS-PAGE 分析后采用BCA 法對(duì)重組蛋白進(jìn)行定量分析，0.22 μm濾器過濾除菌后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組蛋白的抗病毒活性檢測(cè)

1.5.1 VSV 的TCID50測(cè)定 將生長狀態(tài)良好的MDCK和DEF 用完全培養(yǎng)基稀釋為密度為8×104個(gè)/mL，100 μL/孔分別接種于96 孔板，待細(xì)胞長成單層后，每孔分別加入100 μL 由相應(yīng)培養(yǎng)基10 倍倍比稀釋（10-2～10-11）的VSV，每個(gè)濃度6 個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置不加病毒的細(xì)胞對(duì)照組。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)2 h 后棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 維持液繼續(xù)培養(yǎng)，記錄細(xì)胞病變（CPE）情況，直至細(xì)胞狀態(tài)不再變化時(shí)，根據(jù)Read-Muench 法計(jì)算VSV 在兩種細(xì)胞中的TCID50。

1.5.2 rELP-DuIFNγ 體外抗病毒活性檢測(cè) 待接種于96 孔板生長狀態(tài)良好的MDCK 和DEF 長成單層后，分別加入10 倍倍比稀釋的純化的rELPDuIFNγ，每孔100 μL，每個(gè)濃度4 個(gè)重復(fù)；在37 ℃、5%CO2條件下共孵育15 h 后棄掉含蛋白的培養(yǎng)液，接入100 TCID50的VSV，即為抗病毒實(shí)驗(yàn)組；同時(shí)設(shè)置蛋白對(duì)照組（只加倍比稀釋的rELPDuIFNγ），病毒對(duì)照組（只加VSV）和細(xì)胞對(duì)照組（不加rELP-DuIFNγ，也不加VSV）[10-11]。培養(yǎng)18 h 以后開始記錄CPE 的情況，以陽性對(duì)照組75%以上的細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，利用MTT 法對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行染色，二甲基亞砜（DMSO）溶解紫色結(jié)晶后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD490nm值，以抗病毒試驗(yàn)組能保護(hù)50%細(xì)胞不發(fā)生病變的最高稀釋度作為一個(gè)活性單位（U），根據(jù)Read-Muench 法計(jì)算rELP-DuIFNγ 的抗病毒活性。

1.6 rELP-DuIFNγ的體內(nèi)抗病毒作用檢測(cè)將18只4 日齡的櫻桃谷鴨分為3 組，每組6 只，分別為感染DHAV-1 的陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和抗病毒實(shí)驗(yàn)組。病毒感染劑量為100 LD50/只，同時(shí)抗病毒試驗(yàn)組按160 μg/kg 劑量給鴨子灌服rELP-DuIFNγ，48 h/次，連續(xù)3 次。觀察各組鴨子的采食、糞便形態(tài)、精神狀態(tài)、同時(shí)測(cè)定其體溫，記錄各組病死鴨的數(shù)量、發(fā)病時(shí)間，并計(jì)算存活率。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定結(jié)果重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-ELP-DuIFNγ 酶切鑒定結(jié)果顯示，酶切得到約7 000 bp 和450 bp 的目的條帶，與預(yù)期相符（圖1）。進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果顯示，DuIFNγ 基因序列與優(yōu)化的序列同源性為100%。表明重組質(zhì)粒正確構(gòu)建。

圖1 pET30a-ELP-DuIFNγ 的酶切鑒定Fig.1 pET30a-ELP-DuIFNγ digestion identification

2.2 rELP-DuIFNγ的表達(dá)與純化結(jié)果重組菌pET30a-ELP-DuIFNγ/BL21 經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行純化，SDS-PAGE分析表達(dá)蛋白及純化情況。結(jié)果顯示，出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的目的條帶，且目的蛋白主要以可溶性形式表達(dá)，而空載體對(duì)照在對(duì)應(yīng)位置無該目的條帶（圖2）。初步純化的重組蛋白不溶于PBS中，經(jīng)包涵體純化試劑處理后的重組蛋白純度達(dá)90%以上。BCA法測(cè)定rELP-DuIFNγ的濃度為2.4 μg/μL。表明利用ELP的功能優(yōu)勢(shì)得到了高純度、高濃度的rELP-DuIFNγ。

圖2 rELP-DuIFNγ 表達(dá)及純化的SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analysis for the rELP-DuIFNγ expression and purification

2.3 rELP-DuIFNγ體外抗病毒活性檢測(cè)結(jié)果經(jīng)計(jì)算VSV 在MDCK 中的TCID50=10-6.83/0.1 mL，VSV 在DEF 中的TCID50=10-6.17/0.1 mL。10 倍倍比稀釋的rELP-DuIFNγ 分 別 作 用 于MDCK 和DEF，結(jié) 果 顯示，蛋白對(duì)照組（圖3B、4B）未出現(xiàn)明顯的抑制細(xì)胞生長、細(xì)胞死亡等現(xiàn)象，和細(xì)胞對(duì)照組（圖3A、圖4A）相比無顯著變化；經(jīng)MTT 染色法比較兩組OD490nm值無顯著區(qū)別（p＞0.05）。表明rELP-DuIFNγ 對(duì)MDCK與DEF均無毒副作用。

圖3 rELP-DuIFNγ 在VSV/MDCK 系統(tǒng)中抗病毒活性檢測(cè)（40×10）Fig.3 Analysis of antiviral activity of rELP-DuIFNγ in the VSV/MDCK system

采用細(xì)胞病變抑制法測(cè)定rELP-DuIFNγ 的抗病毒活性，在40×10 的熒光倒置顯微鏡下觀察可見，抗病毒試驗(yàn)組（圖3C、圖4C）相對(duì)于病毒對(duì)照組（圖3D、圖4D）可以明顯抑制細(xì)胞病變，具有保護(hù)細(xì)胞的作用；經(jīng)MTT 染色法測(cè)得抗病毒實(shí)驗(yàn)組的OD490nm值顯著高于病毒對(duì)照組（p＜0.05）。根據(jù)Read-Muench 法的公式計(jì)算rELP-DuIFNγ 的抗病毒活性，在VSV/MDCK 系統(tǒng)和VSV/DEF 系統(tǒng)中分別為4.17×104U/mg 和4.54×105U/mg。表 明rELP-DuIFNγ 在MDCK 和DEF 中均具有較高的抗病毒活性，且在不同受體細(xì)胞中的抗病毒活性有較大的差異。

2.4 rELP-DuIFNγ體內(nèi)抗病毒作用結(jié)果感染DHAV-1 的雛鴨灌服rELP-DuIFNγ 后，觀察臨床癥狀。結(jié)果顯示，感染DHAV-1 的陽性對(duì)照組6 只雛鴨在48 h 內(nèi)全部出現(xiàn)精神沉郁、糞便稀軟、嗜睡、抽搐、身體呈弩弓狀等臨床癥狀，并死亡；陰性對(duì)照組雛鴨體溫正常、精神狀態(tài)、生長狀況良好；抗病毒試驗(yàn)組中1 只雛鴨在感染DHAV-1 72 h 后出現(xiàn)臨床癥狀并死亡，感染6 d 時(shí)另外1 只雛鴨出現(xiàn)臨床癥狀，其余雛鴨均精神狀態(tài)良好。經(jīng)統(tǒng)計(jì)計(jì)算陽性組、陰性組、抗病毒實(shí)驗(yàn)組雛鴨的存活率分別為：0、100%、66.67%（表1）。上述結(jié)果表明，rELPDuIFNγ 可以抵抗DHAV-1 對(duì)雛鴨的感染，并延緩發(fā)病時(shí)間，降低發(fā)病率。

圖4 rELP-DuIFNγ 在VSV/DEF 系統(tǒng)中抗病毒活性檢測(cè)（40×10）Fig.4 Analysis of antiviral activity of rELP-DuIFNγ in the VSV/DEF system

表1 rELP-DuIFNγ 體內(nèi)抗病毒結(jié)果Table 1 Antiviral activity analysis of rELP-DuIFNγ in vivo

3 討 論

有研究顯示，重組DuIFNγ 大多數(shù)為組氨酸標(biāo)簽融合蛋白，在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)，需要經(jīng)過變性、復(fù)性處理后再通過親和層析法進(jìn)行純化[8]，操作過程繁瑣、成本較高且下游工程難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化。而ELP 是一類根據(jù)體內(nèi)彈性蛋白重復(fù)序列合成的五肽聚合物[9]，具有溫度敏感的可逆相變特性，即在臨界溫度以下時(shí)以可溶形式溶解在緩沖液中，到達(dá)臨界溫度時(shí)開始集聚，從溶液中析出，可作為純化標(biāo)簽幫助實(shí)現(xiàn)外源蛋白的純化[10]。利用ELP 標(biāo)簽純化蛋白時(shí)僅需要加入NaCl 溶液并調(diào)節(jié)溫度便可以得到純的rELP-DuIFNγ，使得純化過程簡便、成本降低且便于規(guī)?；?。同時(shí)也有文獻(xiàn)證明ELP 能夠增加外源蛋白的可溶性表達(dá)[11]。因此，本研究在構(gòu)建重組DuIFNγ 序列時(shí)插入ELP 序列，旨在經(jīng)原核表達(dá)獲得可溶性的rELP-DuIFNγ，并利用ELP 的可逆相變循環(huán)特性純化重組蛋白，結(jié)果表明純化蛋白的純度可達(dá)到90%以上，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了ELP 在重組IFN 的原核表達(dá)和純化過程中的功能優(yōu)勢(shì)。

重組IFN 除了存在純化難的問題，在體內(nèi)半衰期較短的缺點(diǎn)也亟待解決。由于目前IFN 在臨床應(yīng)用時(shí)需要長期反復(fù)注射，因此延長IFN 的半衰期也是近年來的研究熱點(diǎn)，目前延長IFN 體內(nèi)半衰期的主要策略有聚己二醇化、與抗體Fc 片段融合表達(dá)、與血清白蛋白融合表達(dá)等[12]，而聚乙二醇化反應(yīng)條件和產(chǎn)品質(zhì)量難以控制[13]，與抗體Fc片段、血清白蛋白融合表達(dá)后仍需要通過親和層析純化，操作過程復(fù)雜、成本較高，也難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?。而Bidwell[14]、董文鳳[15]、Kim[16]等報(bào)道ELP 可以延長蛋白半衰期，可作為藥物的傳送載體。因此本研究將ELP 與DuIFNγ融合表達(dá)，在雛鴨體內(nèi)初步探究其抗DHAV-1 的作用，與程俊貞[17]、吳志明[18]等試驗(yàn)中每24 h/次給藥相比較，給雛鴨每隔48 h/次灌服rELP-DuIFNγ，同樣能夠降低雛鴨死亡率，抗病毒效果較好。由此驗(yàn)證了與ELP 融合的重組IFN 較傳統(tǒng)的重組IFN 純化過程簡單且延長了其體內(nèi)的半衰期，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后期重組DuIFNγ制劑、疫苗佐劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

在構(gòu)建重組序列時(shí)，ELP 與目的蛋白的氨基端或羧基端融合位置的選擇主要取決于目的蛋白自身的表達(dá)量[19]。在目的蛋白表達(dá)量較高的情況下，為了減少ELP 標(biāo)簽對(duì)目的蛋白折疊過程的干擾，應(yīng)該先翻譯目的蛋白，再翻譯ELP 標(biāo)簽，所以將目的蛋白的羧基端與ELP 標(biāo)簽融合較為合理；相反，在目的蛋白表達(dá)量不高的情況下，一般將目的蛋白的氨基端與ELP 標(biāo)簽融合，這樣有助于目的蛋白的可溶性表達(dá)[20]。由于DuIFN 自身表達(dá)量低，所以本研究通過預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索了ELP 分別和DuIFNγ 氨基端、羧基端融合之后的表達(dá)量，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：ELP 與目的蛋白氨基端融合為最優(yōu)序列，rELP-DuIFNγ 表達(dá)量較高，這是本研究最終選擇該重組序列的直接原因，而純化結(jié)果和抗病毒作用也證實(shí)了這一設(shè)計(jì)具有理論和實(shí)踐可行性。

本研究合成DuIFNγ 基因時(shí)與ELP 融合表達(dá)，旨在借助ELP 的功能優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)DuIFNγ 的高效可溶表達(dá)，簡便純化，降低生產(chǎn)成本，易于規(guī)?；a(chǎn)，并在體內(nèi)外檢測(cè)其抗病毒活性，為重組DuIFN的實(shí)際應(yīng)用提供新的思路，同時(shí)為研制新型、安全、高效的DuIFN 制品以及探索DuIFN 在臨床防治禽類病毒性疾病的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。