李 岳，閆娜娜，劉愛晶，蘭興鴿，楊 搏，劉長軍，高玉龍，高宏雷，祁小樂，崔紅玉，高 立，李 凱，潘 青，王永強(qiáng)，張艷萍，王笑梅

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/禽傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150069）

雞傳染性貧血病毒（Chicken infectious anemia virus，CAV）是圓環(huán)病毒科環(huán)狀病毒屬的成員之一，引起2～4 周齡雞群發(fā)生傳染性貧血綜合征（CIA）[1]。CAV 無囊膜，病毒顆粒呈20 面體對稱，平均直徑為25 nm～26.5 nm。CAV 的基因組為單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA，大小為2 298 bp 或2 319 bp，編碼3 種病毒蛋白（VP1、VP2 和VP3），其中VP1 為病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒編碼的3 個蛋白中變異率最大的蛋白，其高變區(qū)位于aa139～aa151；VP2 為非結(jié)構(gòu)蛋白，是CAV 最保守的蛋白，具有雙重特異性蛋白磷酸酶活性；VP3 又稱為凋亡素，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

自1979 年Yuasa 等在日本首次分離到CAV（Gifu-1 株）[2]，隨后英國、美國、澳大利亞等均有該病的報道，目前，該病呈全球性流行，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國于1992 年首次分離并報道了該病毒[3]，隨后，廣西、江蘇、山東、廣東等地也陸續(xù)報道了該病的流行[4-7]。目前，CAV 只有一個血清型，但是不同地區(qū)CAV 分離株之間序列存在差異，毒力也有所不同[8-9]。為了解近年來CAV 在我國規(guī)?；B(yǎng)雞場的流行情況，2016 年1 月～2019 年9月，對黑龍江、北京、山東等13 個省市疑似CAV陽性雞場進(jìn)行PCR 檢測，并于MDCC-MSB 1 細(xì)胞中分離得到1 株CAV，并對分離株VP1 基因進(jìn)行了序列分析。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源和細(xì)胞2016 年1 月～2019 年9月，從山東（30 個）、內(nèi)蒙古（18 個）、湖南（8 個）、北京（22 個）、江蘇（16 個）、黑龍江（121 個）、遼寧（49 個）、甘肅（4 個）、寧夏（3 個）、吉林（71 個）、廣西（15 個）、河南（16 個）和安徽（8 個）等13 個省市疑似發(fā)病的381 個雞群中采集肝臟病料樣品共1 677 份，病料樣品于-20 ℃保存?zhèn)溆?。雞馬立克氏病脾淋巴瘤繼代細(xì)胞系（MDCC-MSB 1 細(xì)胞）由本實驗室保存。

1.2 主要試劑1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、FITC 標(biāo)記的兔抗鼠IgG 購自Sigma 公司；胎牛血清購自Gibco 公司；Primer Star 高保真DNA 聚合酶、Ex TaqDNA 聚合酶、pMD18-T 載體、DL2000 Marker 均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA 提取試劑盒購自AxyGen公司；質(zhì)粒pCAGGs-VP1 及CAV VP3 單克隆抗體（BC11）由本實驗制備與保存。

1.3 引物設(shè)計與合成根據(jù)CAV 參考株Cux-1 基因組序列（M55918.1），設(shè)計合成引物CAV VP1R/F，用于擴(kuò)增CAV VP1 基因。參照文獻(xiàn)分別合成CAV[10]、雞馬立克氏病病毒（MDV）[10]、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）[10]、禽白血病病毒（ALV）[10]及禽腺病毒（FADV）[11]（表1）。上述引物均由吉林庫美生物科技股份有限公司合成。

表1 實驗用引物序列Table 1 Sequences of the primers used in the present study

1.4 病料樣品中CAV 的檢測無菌取發(fā)病雞肝臟，加入1 mL PBS，利用高通量組織研磨儀研磨破碎，震蕩研磨兩次，獲得組織勻漿液后6000 r/min離心5 min，取200 μL 上清，利用DNA 提取試劑盒提取病毒DNA，利用引物CAVR/F 進(jìn)行PCR 檢測。統(tǒng)計2016 年1 月～2019 年9 月來自疑似發(fā)病的381 個雞群1 677 份肝臟樣品中的CAV 陽性樣品數(shù)量及陽性雞群數(shù)量。

1.5 病料樣品中其它免疫抑制病的檢測取經(jīng)檢測為CAV 陽性的病料樣品DNA，采用MDV、REV、ALV 及FADV 特異性引物（MDVR/F、REVR/F、ALVR/F 及FADV R/F）分別進(jìn)行PCR 檢測。統(tǒng)計分析CIA 與其它免疫抑制病混合感染情況。

1.6 病毒分離與鑒定

1.6.1 病毒分離 取來自山東臨沂某CAV 陽性雞場采集的肝臟樣品研磨上清，70 ℃金屬浴加熱5 min去除外源囊膜病毒，6000 r/min 離心5 min，取上清經(jīng)0.22 μm 濾器過濾除菌，接種MDCC-MSB 1 細(xì)胞，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)3 d。收獲接毒細(xì)胞，反復(fù)凍融3 次，2000 r/min 離心3 min，收集上清，按25%比例接種MDCC-MSB 1 細(xì)胞，連續(xù)傳代6 次，反復(fù)凍融后收集上清儲存于-80 ℃冰箱備用。1.6.2 PCR 鑒定 取1.6.1 分離獲得的病毒液200 μL，提取病毒DNA后，利用引物CAV R/F進(jìn)行PCR檢測。

1.6.3 間接免疫熒光（IFA）鑒定 取第6 代病毒液接種MDCC-MSB 1 細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3 d 后，采用預(yù)冷的95%酒精固定于48 孔板，以CAV VP3 MAb BC11（1∶400）為一抗，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的兔抗鼠IgG（1∶200）為二抗進(jìn)行IFA 鑒定。

1.6.4 分離病毒的VP1 基因克隆、測序及序列分析取1.6.2 病毒DNA 為模板，利用引物CAV VP1R/F 擴(kuò)增CAV VP1 基因，回收PCR 產(chǎn)物并克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，選取3 個菌液PCR鑒定為陽性的單克隆，由吉林庫美生物科技股份有限公司測序。采用DNAStar 軟件對分離病毒株VP1基因及GenBank 中19 株參考株VP1 基因進(jìn)行序列比對及分析，采用MEGA 6.0.軟件繪制遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1 病料樣品中CAV 的檢測結(jié)果對采集的1 677份疑似CIA 陽性肝臟病料樣品進(jìn)行PCR 檢測。結(jié)果顯示，CAV 陽性肝臟病料樣品242 份，平均陽性率為14.43%（242/1677），雞群陽性率達(dá)到22.31%（85/381）；各年樣品CAV 陽性率5.36%～16.54%，雞群陽性率12.50%～25.69%（表2）。

對13 個省市中疑似發(fā)病的381 個雞群進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CAV 感染普遍存在于調(diào)查的13 個省市中，雞群陽性率12.50%～50%。其中，黑龍江省為調(diào)查雞群數(shù)目最多的省份，共有121 個疑似CAV 發(fā)病雞群，陽性率為24.79%（表3）。

表2 2016 年1 月～2019 年9 月我國部分 地區(qū)CAV 的檢測結(jié)果Table 2 CAV detection in some areas of China during January 2016-September 2019

表3 2016 年1 月～2019 年9 月我國部分地區(qū)CAV 陽性雞群的分布Table 3 The distribution of CAV-positive flocks in some areas of China during January 2016-September 2019

2.2 病料樣品中其它免疫抑制病病毒檢測結(jié)果取經(jīng)檢測為CAV 陽性的病料樣品DNA，進(jìn)行CAV 與其它免疫抑制病病毒混合感染情況檢測，結(jié)果顯示，2016 年1 月～2019 年9 月，單獨感染CAV 雞群比率為47.06%（40/85），與其它免疫抑制病病毒混合感染率為52.94%（45/85）?；旄蓄愋桶–AV 與MDV、CAV 與ALV、CAV 與REV 雙重感染，CAV、MDV 與ALV 三重感染，CAV、MDV、REV 與ALV四重感染等，其中，CAV 與MDV 雙重感染占混合感染的比例為61%（圖1）。表明CAV 與其他免疫抑制病病毒混合感染在調(diào)查雞場中普遍存在，并且CAV 與MDV 雙重感染為最主要的混合感染類型。

圖1 調(diào)查雞群中CAV 及其他免疫抑制病病毒混合感染的檢測結(jié)果Fig.1 Detection of CAV and other immunosuppressive diseases in chicken flocks

2.3 病毒分離株的鑒定結(jié)果

2.3.1 PCR鑒定 將PCR檢測為陽性的來自山東臨沂某CAV 陽性雞場的1份肝臟處理液接種MDCC-MSB 1細(xì)胞，連續(xù)傳代6 次后，提取其細(xì)胞培養(yǎng)物上清DNA，采用引物CAV F/R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示在約600 bp 獲得與陽性對照（pCAGGs-VP1）一致的條帶（圖2），初步表明從山東臨沂某CAV 陽性雞場的肝臟病料樣品中分離到1 株CAV。

圖2 CAV-SD19/4604 分離株P(guān)CR 檢測Fig.2 PCR detection of CAV-SD19/4604 isolate

2.3.2 分離株IFA 鑒定結(jié)果 將收獲的P6 代病毒液接種MDCC-MSB 1，利用IFA 對分離病毒株作進(jìn)一步鑒定，同時以空白細(xì)胞為對照。結(jié)果顯示，接種P6 代病毒液的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的綠色熒光（圖3A），而空白細(xì)胞未見熒光（圖3B），進(jìn)一步證明分離到1株CAV，命名為CAV-SD19/4604。

圖3 IFA 鑒定分離株CAV-SD19/4604Fig.3 IFA identification of CAV-SD19/4604 isolate

2.4 分離株VP1 同源性及遺傳進(jìn)化分析利用引物CAV VP1R/F PCR 擴(kuò)增分離病毒株CAV-SD19/4604的VP1 基因，獲得1 400 bp 左右目的片段，將目的片段克隆至pMD18-T 中測序。序列分析表明，分離病毒株CAV-SD19/4604 VP1 基因全長為1 350 bp，無基因缺失及插入，并將其上傳至GenBank。與Gen-Bank 中登錄的19 株CAV 參考株的VP1 基因序列作同源性分析，結(jié)果顯示分離病毒株VP1 基因與19株參考株VP1 基因的同源性為95.00%～98.80%。對分離株及參考株的VP1 基因繪制遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，CAV-SD19/4604 及參考株VP1 基因可分為Ⅰ、Ⅱ兩群，分離株CAV-SD19/46049（MN746999）位于Ⅰ群，并且與C369（AB046590）、HN9（DQ141672）、GD101（KU050680）、GD104（KU050679）、CIA89-69（JF507715）等亞洲病毒株位于同一分支（圖4），表明分離病毒株與亞洲流行病毒株親緣關(guān)系較近。

圖4 CAV-SD19/4604 分離株VP1 基因的進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on VP1 gene of the isolate CAV-SD19/4604

3 討 論

CAV 主要攻擊雞的T 細(xì)胞以及骨髓中的成血細(xì)胞，是引起雞群發(fā)生免疫抑制病的主要病原之一[12]。我國于1992 年由崔現(xiàn)蘭等首次分離報道該病毒后，廣西、安徽、山東等地也相繼發(fā)現(xiàn)了該病的流行。2016 年1 月～2019 年9 月，本研究對13 個 省市的疑似發(fā)病雞群開展調(diào)查，發(fā)現(xiàn)了較高的CAV 陽性雞群（22.31%），調(diào)查結(jié)果顯示CAV 感染普遍存在于我國13 個省市的規(guī)模化養(yǎng)殖場，雞群中有不同程度的CAV 感染；2016 年1 月～2019 年9 月雞群CAV陽性率在12.50%～25.69%，表明近年來CAV 感染在我國呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢，但并未暴發(fā)CIA 疫情。對越南北部10 個省份的64 個雞群進(jìn)行檢測，CAV 普遍存在于檢測省份中并且陽性雞群檢出率達(dá)到73.4%[13]。伊朗全國范圍內(nèi)普遍存在CAV，雞群陽性率58.4%[14]。CAV 與MDV、REV 或ALV 等免疫抑制病病毒的混合感染，可使CAV 的致病性增強(qiáng)，雞群病癥加劇，死亡增加；這可能是引發(fā)目前我國部分地區(qū)雞群多種疾病暴發(fā)，使養(yǎng)雞業(yè)的疫病更加復(fù)雜和嚴(yán)重的主要原因之一[15]。對2016 年1 月～2019 年9 月雞群中CAV及其他免疫抑制病病毒檢測結(jié)果顯示，CAV 混合感染其他免疫抑制病病毒為主要感染類型，占據(jù)CAV感染總量的52.94%；值得注意的是，調(diào)查的85 個CAV 陽性雞群中，共檢測出26 個雞群（57.78%）為MDV 陽性，但是CAV 與其他免疫抑制病病毒混合感染比例不高，表明在本次調(diào)查中，CAV 與MDV 混合感染為最常見的混感類型，雞群中MD 的免疫失敗可能與CAV 早期感染有關(guān)[16]。

CAV 可以在T 細(xì)胞系MDCC-MSB 1 細(xì) 胞、1 日齡雞或雞胚中增殖。本研究用來自山東臨沂某CAV 陽性雞場的肝臟病料樣品接種MDCC-MSB 1 細(xì)胞，傳代6 次收集病毒液，經(jīng)PCR 及IFA 鑒定獲得1 株CAV 細(xì)胞適應(yīng)毒，命名為CAV-SD19/4604。對其VP1 基因與GenBank 中19 株參考株VP1 基因進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，分離病毒株與中國分離株GD104 親緣關(guān)系最近，同源性為98.80%。同時，采用MEGA對分離株及其他病毒株繪制遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，CAV-SD19/4604 與大多數(shù)亞洲分離株位于同一分支，具備亞洲流行株的特征。據(jù)報道，VP1 蛋白的394 位氨基酸是主要的毒力決定位點，若394 位為谷氨酰胺（Q），則具備高致病性病毒株特征，相對應(yīng)的，若病毒株394 位氨基酸為組氨酸（H），則為低致病性病毒株[17]。在本研究中，分離株CAVSD19/4604 VP1 蛋白394 氨基酸為谷氨酰胺（Q），具備高致病性病毒株特征。Renshaw 等人研究發(fā)現(xiàn)，VP1 蛋白139 及144 位氨基酸影響著病毒增殖及傳播能力[18]，分離株VP1 蛋白的139 位氨基酸為賴氨酸（K），144 位氨基酸為谷氨酸（E），CAV-SD19/4604可以在易感細(xì)胞MDCC-MSB 1 中正常增殖傳播。

本研究調(diào)查了我國部分地區(qū)CAV 感染情況，CAV 普遍存在于調(diào)查雞群中并且與多種免疫抑制病病病毒混合感染，使雞群處于免疫抑制狀態(tài)，增加了雞群對其他病原體的易感性及免疫失敗的風(fēng)險。因此，加強(qiáng)CAV 流行情況的監(jiān)測，剔除CAV 陽性雞群對我國養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展具有重大意義。