王磊,楊承槐,劉瑩

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

與哺乳動(dòng)物原代細(xì)胞相比，傳代細(xì)胞系在生物制品研發(fā)、生產(chǎn)過(guò)程中具有突出的優(yōu)勢(shì)[1]，已有多種傳代細(xì)胞系成功應(yīng)用于生物制品生產(chǎn)、檢驗(yàn)的各個(gè)環(huán)節(jié)[2]。傳代細(xì)胞系自身的特性(諸如染色體特性、致瘤性等)與生物制品的安全性息息相關(guān)。因此，國(guó)內(nèi)無(wú)論是人用還是獸用生物制品法典都明確要求特定的傳代細(xì)胞系或二倍體細(xì)胞作為疫苗生產(chǎn)用基質(zhì)前，必須對(duì)特定代次進(jìn)行胞核學(xué)檢驗(yàn)[3-4]。細(xì)胞染色體制片是胞核學(xué)檢驗(yàn)中的重要環(huán)節(jié)，影響因素較多，對(duì)環(huán)境和操作的要求較高，任何一個(gè)條件控制不好都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞染色體分散度差、長(zhǎng)度不適于觀察計(jì)數(shù)、結(jié)果重復(fù)性不好，進(jìn)而影響到后續(xù)的檢驗(yàn)結(jié)果[5-6]。

國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心(國(guó)家獸醫(yī)微生物資源平臺(tái))保藏的倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系(CHO)、豬睪丸細(xì)胞系(ST)、羊睪丸細(xì)胞系(OA3.Ts)、牛腎細(xì)胞系(MDBK)、兔腎細(xì)胞系(RK-13)既具有種屬代表性又是生物制品研發(fā)和生產(chǎn)中的常用生產(chǎn)基質(zhì)[7-8]。本研究參考人類(lèi)羊水細(xì)胞以及多種原代細(xì)胞的染色體制備方法，對(duì)以上6種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的染色體制片條件進(jìn)行優(yōu)化研究，旨在對(duì)鼠源、豬源、羊源、牛源、兔源傳代細(xì)胞系的染色體制片提供有益借鑒和參考。

1 材料方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 細(xì)胞系 BHK-21細(xì)胞第55代，批號(hào)20170719；CHO(代次不明)，批號(hào)20160721；ST細(xì)胞第125代，批號(hào)20170621；OA3.Ts細(xì)胞第29代，批號(hào)20160806；MDBK細(xì)胞第9代，批號(hào)20170623；RK-13細(xì)胞第24代，批號(hào)20181130；均來(lái)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 秋水仙素(沃凱，批號(hào)20171202)配制成100 μg/mL溶液、固定液(甲醇(滬試，批號(hào)20170821)：乙酸(國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)20161010)=3∶1)、KCl(Vetec，批號(hào)wxbc4662v)配制成0.4%(g/V)溶液和0.075 mol/mL溶液、DMEM(Gibco，批號(hào)8119416)、胎牛血清(PAN，批號(hào)ST170802)、0.25% EDTA-胰蛋白酶(Gibco，批號(hào)1953147)、0.01 mol/L PBS緩沖溶液(實(shí)驗(yàn)室配制)、吉姆薩染液(Solarbio,批號(hào)20161124)。

1.1.3 主要儀器 Leica核型分析系統(tǒng)(型號(hào) CyoVision capture station)、Hettich離心機(jī)(型號(hào)320R)、Thermo CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)Heracell 240i)、Nikon倒置顯微鏡(型號(hào)TS100)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)條件 分別將凍存管中的CHO、BHK-21、ST、OA3.Ts、MDBK、RK-13六種細(xì)胞在37 ℃水浴中融化后，各加入含10 mL DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清)的25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 染色體制片 待6種細(xì)胞均長(zhǎng)成良好單層時(shí)，以1∶2比例傳代至相應(yīng)瓶數(shù)。隨后分別按照以下方法進(jìn)行制片條件的優(yōu)化(表1)。

表1 染色體制片優(yōu)化條件選擇Tab 1 Selection of optimal conditions for chromosome production

傳代后培養(yǎng)24 h時(shí)滴加秋水仙素(終濃度分別為1 μg/mL、4 μg/mL、7.5 μg/mL)處理1 h。隨后吸凈培養(yǎng)液，加1 mL胰酶消化中和后，充分吹散細(xì)胞。1 200 r/min離心,8 min收集細(xì)胞沉淀。細(xì)胞沉淀中加入8 mL KCl低滲液(濃度分別為0.4%和0.075 mol/mL)，將細(xì)胞沉淀團(tuán)塊吹散后室溫處理不同時(shí)間(20 min、40 min、60 min)；然后加入3 mL固定液，混勻，1 200 r/min離心8 min，棄掉上清液。重復(fù)滴加固定液、離心處理兩次后，重懸于2 mL的固定液中。將固定處理好的細(xì)胞滴在-20 ℃預(yù)冷的干凈玻片上，干燥后，用Giemsa染色液浸泡8 min，用純化水輕柔沖洗干凈。對(duì)分散較好的單個(gè)細(xì)胞的染色體視野用CytoVision System (Applied Imaging)軟件進(jìn)行圖像拍攝并統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目，共統(tǒng)計(jì)50個(gè)以上細(xì)胞的染色體條數(shù)。

2 結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同細(xì)胞在不同秋水仙素濃度、低滲液濃度、低滲液處理時(shí)間的條件摸索發(fā)現(xiàn),以上六種細(xì)胞系用25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶傳代后培養(yǎng)24～48 h，1 μg/mL的秋水仙素處理60 min，處在中期分裂相的細(xì)胞最多，視野中染色體長(zhǎng)度適中，用0.4% KCl溶液低滲處理40 min，細(xì)胞中染色體在載玻片上形態(tài)最佳，分散度最好(圖1)。

A：BHK-21細(xì)胞；B：CHO細(xì)胞；C：MDBK細(xì)胞； D：OA3.Ts細(xì)胞；E：ST細(xì)胞；F：RK-13細(xì)胞A：BHK-21 cell;B：CHO cell;C:MDBK cell;D：OA3.Ts cell;E：ST cell;F：RK-13 cell圖1 條件優(yōu)化后的六種傳代細(xì)胞系染色體制片效果(100倍油鏡觀察)Fig 1 Chromosome slicing effect of optimized six cell lines (100-fold oil microscopic observation)

鏡下觀察六種傳代細(xì)胞的染色體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，高倍鏡下挑選50 個(gè)以上染色體輪廓清晰分散良好的處于中期細(xì)胞，精確計(jì)數(shù)每個(gè)細(xì)胞的染色體數(shù)，通過(guò)統(tǒng)計(jì)確定六種細(xì)胞眾數(shù)結(jié)果(表2)。

表2 六種細(xì)胞染色體條數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab 2 Mode number of chromosomes of six cell lines

3 討論與結(jié)論

由于細(xì)胞染色體的核型作為一種特異性的細(xì)胞遺傳信息很好地表現(xiàn)出自身的種質(zhì)特性[1]，因此胞核學(xué)檢驗(yàn)通過(guò)染色體核型檢查可以清楚地反映細(xì)胞系的遺傳背景和傳代的穩(wěn)定性(傳代過(guò)程中的染色體是否發(fā)生畸變或者缺失等情況)[9]。研究發(fā)現(xiàn)：ST細(xì)胞眾數(shù)與豬源原代細(xì)胞染色體眾數(shù)(2n=38)一致，占細(xì)胞總數(shù)的67.1%，說(shuō)明該細(xì)胞系染色體分布頻率在正常二倍體細(xì)胞附近；其他五種細(xì)胞的眾數(shù)與其對(duì)應(yīng)原代細(xì)胞相比，均有不同程度的偏差，并且染色體的數(shù)量分布也較為離散。張德禮等認(rèn)為細(xì)胞的致瘤性與否和細(xì)胞系染色體的變異情況直接相關(guān)，細(xì)胞系染色體的眾數(shù)與原代細(xì)胞相比偏離的越高、染色體數(shù)目范圍越寬，出現(xiàn)致瘤性的幾率就越大[10-12]。

細(xì)胞染色體制片質(zhì)量的好壞會(huì)直接影響胞核學(xué)檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性和檢驗(yàn)效率[13]。秋水仙素的處理對(duì)染色體的形態(tài)和處于中期分裂相的數(shù)量起到了關(guān)鍵作用。秋水仙素具有細(xì)胞毒性，會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致染色體分裂抑制，形態(tài)變異[14]。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[5,7]，結(jié)合細(xì)胞染色體制備經(jīng)驗(yàn)，對(duì)秋水仙素的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)使用終濃度為1 μg/mL的秋水仙素處理后，細(xì)胞染色體臂長(zhǎng)適中并且形態(tài)最佳；秋水仙素的濃度過(guò)高或時(shí)間較長(zhǎng)，染色體會(huì)呈“點(diǎn)”狀(圖2B)，導(dǎo)致后續(xù)G帶顯色分析時(shí)帶型無(wú)法分辨；秋水仙素濃度過(guò)低或處理時(shí)間過(guò)短，染色體會(huì)因?yàn)殚L(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)而糾纏在一起(圖2C)，也影響后續(xù)的結(jié)果分析。秋水仙素處理細(xì)胞的時(shí)機(jī)亦會(huì)影響到染色體的形態(tài)以及長(zhǎng)度。秋水仙素處理的時(shí)機(jī)應(yīng)盡量選擇在細(xì)胞系傳代后24～48 h，細(xì)胞生長(zhǎng)90%至剛剛長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞瓶時(shí)。錯(cuò)誤的處理時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致處于中期分裂相的細(xì)胞過(guò)少，或者滴片后細(xì)胞染色體的分散度不好呈“菊花”狀(圖2A)。

滴片后染色體的分散程度常與低滲液的處理是否合適有關(guān)。常見(jiàn)的低滲溶液包括KCl溶液、檸檬酸鈉溶液或者氯化鈉溶液[15-16]。0.075 mol/mL的KCl溶液作用20～60 min多用于傳代細(xì)胞系和羊水細(xì)胞的低滲處理[13,17]。為了嘗試在低滲過(guò)程中使細(xì)胞膨脹更加充分，在滴片后得到最佳的染色體分散效果，本研究增加了1組濃度更低的低滲液(0.4% KCl)處理。結(jié)果表明，待檢細(xì)胞用0.4% KCl溶液在37 ℃水浴中處理40 min時(shí)的低滲效果最佳，細(xì)胞滴片后染色體分散適中，破碎釋放染色體的細(xì)胞視野較多。而采用濃度過(guò)低的低滲液或者處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在滴片前就提前破碎，滴片后視野背景中會(huì)出現(xiàn)大量游離的染色體。采用濃度過(guò)高的低滲液或者低滲液處理時(shí)間過(guò)短會(huì)造成等滲的效果，在滴片后沒(méi)有細(xì)胞破碎釋放出染色體(圖2D)，得不到理想的染色體中期分裂相視野。

除以上涉及的影響因素外，細(xì)胞的培養(yǎng)狀態(tài)、傳代比例甚至是滴片時(shí)的溫濕度條件和載玻片的質(zhì)量亦會(huì)對(duì)制片效果產(chǎn)生很重要的影響。胞核學(xué)檢驗(yàn)是一個(gè)很經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法，如何將染色體制片的過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化，滿(mǎn)足多種屬細(xì)胞檢驗(yàn)需求，是今后下一步的努力方向。

A.染色體呈“菊花狀”(ST細(xì)胞)；B.染色體呈“點(diǎn)狀”(OA3.Ts細(xì)胞)；C.染色體長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)(MDBK細(xì)胞)；D.染色體分散度差(OA3.Ts細(xì)胞)A.The chromosome is “chrysanthemum like” (ST cell);B.The chromosome is “punctate”(OA3.Ts細(xì)胞);C.Chromosome length is too long(MDBK cell);D.Poor chromosome dispersion(OA3.Ts cell)圖2 染色體制片過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題Fig 2 Common problems in chromosome production