趙建平，李艷玲，張春霞，王亞利，常鳳姣，李利紅

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院，鄭州 450000)

缺鈣是動物一種常見疾病，多發(fā)生在動物的生長階段和老年階段。嚴重影響了寵物和食品動物的經(jīng)濟效益。缺鈣易導致寵物畸形和影響毛色的光澤度，也會影響食品動物的肉的品質(zhì)。所以補鈣已經(jīng)成為畜牧業(yè)重點關(guān)注的問題。

動物的補鈣產(chǎn)品雖然很多，但把中藥和補鈣相結(jié)合在一起的卻基本沒有。參術(shù)補鈣顆粒是中西藥復方制劑，由甘草、黨參、白術(shù)等五味中藥再加入維生素D3、碳酸鈣，以淀粉、蔗糖等輔料制備而成的，為淡黃色至棕黃色的顆粒，氣味微甜。在該產(chǎn)品中，中藥調(diào)理脾胃促進食欲消化，西藥補鈣補充維生素D。其功效為益氣健脾、補充鈣質(zhì)。本實驗通過對參術(shù)補鈣顆粒中甘草、白術(shù)、黨參三味藥進行薄層鑒別來作為定性鑒別標準，通過對鈣和維生素D3用高效液相進行含量測定來進行定量控制，力求制定出能夠很好控制參術(shù)補鈣顆粒質(zhì)量的標準。

1 材 料

1.1 藥材 甘草、黨參、白術(shù)、山藥和茯苓均購自北京同仁堂有限公司，經(jīng)鑒定甘草是豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)的干燥根和根莖；黨參是桔?？浦参稂h參(Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf.)的干燥根；白術(shù)是菊科植物黨參(Atractylodes macrocephala)的干燥根莖；山藥是薯蕷科植物薯蕷(Dioscorea opposita Thunb.) 的干燥根莖；茯苓是多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos(Schw.)Wolf)的干燥菌核。

1.2 標準品 維生素D3(含量：不低于99%，批號：A06J9L65206,上海源葉生物)；碳酸鈣工作基準試劑(含量：99.95%～100.05%)；甘草對照藥材(批號：161213-04，成都普思生物科技公司)；黨參對照藥材(批號：P23N9F75819，上海源葉生物)；白術(shù)對照藥材(批號：Z08A9B67489，上海源葉生物)；山藥對照藥材(批號：Y19A9H59254，上海源葉生物)；茯苓對照藥材(批號：P12J9F65406，上海源葉生物)

1.3 樣品 參術(shù)補鈣顆粒及陰性樣品均由河南牧業(yè)經(jīng)濟學院制藥工程學院自制。

1.4 儀器 原子吸收分光光度計(型號WFX-120B,北京瑞利分析儀器有限公司)，Waters高效液相色譜儀(型號Alliance),電子天平(型號BSA224S,北京賽多利斯科學儀器有限公司).

1.5 試劑 正己烷(分析純)，甲醇(分析純)，鹽酸(分析純)，氧化鑭(分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層定性鑒別

2.1.1 甘草的薄層鑒別

2.1.1.1 供試品的制備 稱取樣品5.00 g，加三氯甲烷40 mL，加熱回流1 h后過濾，藥渣揮盡三氯甲烷(沒刺激性氣味即可)，殘渣加甲醇50 mL，加熱回流1 h后濾過，濾液蒸干用水30 mL溶解，用水飽和過的正丁醇振搖提取兩次，每次25 mL，正丁醇液蒸干，加甲醇0.5 mL溶解，作為供試品。

2.1.1.2 陰性對照的制備 取缺甘草的陰性樣品，同上述供試品的方法制備。

2.1.1.3 對照藥材的制備 同供試品的制備。

2.1.1.4 薄層鑒別 取上述樣品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G板上，以三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇：水(15∶40∶22∶10)10 ℃以下放置的下層溶液作為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇，加熱5至10 min，置紫外365 nm下檢視(圖1)。

1、缺甘草陰性對照溶液；2-4二批、三批和四批供試品溶液；5、甘草對照藥材溶液1、Licorice deficiency negative control solution；2-4、Two,three and four batches of test solution；5、Glycyrrhiza reference solution圖1 甘草薄層鑒別色譜圖(紫外365 nm)Fig 1 TLC identification chromatogram of Glycyrrhiza uralensis Fisch

薄層鑒別結(jié)果顯示：在和甘草對照藥材相對應(yīng)的位置，樣品2、3、4均出現(xiàn)清晰斑點，并且甘草陰性對照溶液在該位置無斑點。因此該方法可以用來定性鑒別參術(shù)補鈣顆粒中的甘草。

2.1.2 黨參的薄層鑒別

2.1.2.1 供試品的制備 稱取樣品5.00 g，加水30 mL、鹽酸3 mL，加熱回流1 h，放涼后濾過，濾液用二氯甲烷提取三次，每次20 mL，合并二氯甲烷液，蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。

2.1.2.2 陰性樣品的制備 取缺黨參的陰性樣品，同供試品的方法制備。

2.1.2.3 對照藥材的制備 稱取對照品0.50 g，加水10 mL、鹽酸1 mL，加熱回流1 h，放涼后濾過，濾液用三氯甲烷提取三次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加0.5 mL甲醇溶解，作為對照藥材溶液。

2.1.2.4 薄層鑒別 吸取上述溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(20∶8∶0.5)為展開劑中展開，取出，晾干。噴10%硫酸乙醇，105 ℃加熱至樣點清晰顯現(xiàn)(圖2)。

1、黨參對照品溶液；2、缺黨參陰性對照溶液；3-5二批、三批和四批供試品溶液1、Dangshen reference solution；2、Negative control solution of Codonopsis pilosula；3-5、Two,three and four batches of test solution圖2 黨參薄層鑒別色譜圖譜Fig 2 TLC chromatogram of Codonopsis pilosula

薄層鑒別結(jié)果顯示：在和黨參對照藥材相對應(yīng)的位置，樣品2、3、4均出現(xiàn)清晰斑點，并且黨參陰性對照溶液在該位置無斑點。因此該方法可以用來定性鑒別參術(shù)補鈣顆粒中的黨參。

2.1.3 白術(shù)的薄層鑒別

2.1.3.1 供試品的制備 稱取樣品3.00 g，加水飽和過的正丁醇40 mL,超聲30 min后過濾，濾液用水洗滌兩次，每次20 mL，棄去水液，蒸干，殘渣加1 mL丙酮溶解。

2.1.3.2 陰性對照的制備 取缺白術(shù)的陰性樣品，同法制備陰性對照

2.1.3.3 對照品的制備 取白術(shù)的對照藥材，按照供試品的前處理方法制備。

2.1.3.4 薄層鑒別 吸取上述樣品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：丙酮(19∶1)作為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外365 nm下檢視(圖3)。

1、缺白術(shù)陰性對照溶液；2-4二批、三批和四批供試品溶液；5、白術(shù)對照藥材溶液1、Negative control solution of Atractylodes macrocephala；2-4、Two,three and four batches of test solution；5、Atractylodes macrocephala reference solution圖3 白術(shù)薄層鑒別色譜圖譜(紫外365 nm)Fig 3 TLC chromatogram of Atractylodes macrocephala (UV 365 nm)

薄層鑒別結(jié)果顯示：在和白術(shù)對照藥材相對應(yīng)的位置，樣品2、3、4均出現(xiàn)清晰斑點，并且白術(shù)陰性對照溶液在該位置無斑點。因此該方法可以用來定性鑒別參術(shù)補鈣顆粒中的白術(shù)。

2.2 含量測定

2.2.1 鈣的含量測定

2.2.1.1 標準品溶液的制備 精密稱取碳酸鈣基準試劑60 mg于100 mL容量瓶，加10 mL水潤濕，再用5 mL稀鹽酸溶解后加水至刻度，搖勻，從中精密量取25 mL于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取1.0、1.5、2.0、2、3.0 mL分別置于25 mL量瓶中，各加鑭試液1 mL，加水至刻度后，搖勻，即得一系列不同濃度的對照品溶液。

2.2.1.2 供試品溶液和陰性對照溶液的制備 將參術(shù)補鈣顆粒粉碎，陰性對照品(參術(shù)補鈣顆粒缺鈣)研細，過60目篩，精密稱定0.5 g或0.3 g置100 mL容量瓶中，加10 mL水潤濕，再用5 mL稀鹽酸溶解，加水至刻度，搖勻，過濾，從續(xù)濾液中精密量取2 mL置于25 mL容量瓶中，加1 mL鑭試液，加水至刻度，搖勻，得供試品溶液和陰性對照溶液。

2.2.1.3 空白對照溶液的制備 于100 mL容量瓶中加10 mL水，再加5 mL稀鹽酸后加水至刻度，搖勻，從中精密量取2 mL置于25 mL容量瓶中，加鑭試液1 mL，加水至刻度，搖勻，即得。

2.2.1.4 測定法 用火焰原子吸收分光光度計按照原子吸收分光光度法第一法標準曲線法在422.7 nm的波長處測定，即得。

2.2.1.5 標準曲線的制備 由上述標準品溶液的制備得到6、9、12、15、18 μg/mL一系列不同濃度的標準品溶液，再加上空白對照溶液，用原子吸收分光光度法，每個濃度平行測定3次，得標準曲線方程y=0.0177x+0.1072，r=0.999836，鈣在0～18 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖4 鈣標準曲線Fig 4 Calcium standard curve

2.2.1.6 精密度的測定 取供試品溶液4的2號，連續(xù)測定6次，考察方法的精密度，RSD為2.75%。

2.2.1.7 重復性試驗 精密稱取同一批的參術(shù)補鈣顆粒6份，按供試品溶液的制備方法處理，測定樣品中鈣的含量，結(jié)果平均含量為11.79 mg/g，RSD為2.13%。

2.2.1.8 樣品中鈣含量的測定 分別取8個批次的參術(shù)補鈣顆粒，按照2.2.1.2項下供試品制備方法制備供試品溶液，每個批次平行處理兩份。按照2.2.1.4項下測定方法分別測定可得樣品中鈣含量，結(jié)果見表1。

表1 鈣標準曲線數(shù)據(jù)Tab 1 Calcium standard curve data

根據(jù)測定結(jié)果，取8個批次平均含量的80%做為定量限，參術(shù)補鈣顆粒中所含鈣的含量定為8.76 mg/g。

2.2.2 維生素D3的含量測定

2.2.2.1 色譜條件 流動相：甲醇∶水(98∶2)；色譜柱：WAT054275 C18柱；檢測波長：264 nm。

2.2.2.2 標準品溶液的制備 精密稱取VD3標準品5 mg于5 mL容量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，得C=1.0 mg/mL的VD3標準貯備液。從中精密量取1 mL置于蒸發(fā)皿中，使溶劑揮干，用甲醇溶解殘渣轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并稀釋至刻度搖勻，得C=100 μg/mL的VD3標準工作液，從中精密量取1 mL置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得C=10 μg/mL的標準工作液。

2.2.2.3 原料藥溶液的制備 精密稱取VD3原料藥1 g于具塞錐形瓶中，加25 mL正己烷，超聲提取30 min，過濾至25 mL容量瓶中，用正己烷補足至刻度，搖勻，從中精密量取1 mL至蒸發(fā)皿中揮干，用甲醇溶解殘渣轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2.4 供試品溶液及陰性對照品溶液的制備 稱取陰性對照品(參術(shù)補鈣顆粒缺VD3)20 g，樣品50 g，分別置于具塞錐形瓶中，加正己烷150 mL，超聲提取30 min，過濾至蒸發(fā)皿中，濾液揮干后用甲醇溶解殘渣轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2.5 測定法 分別吸取VD3標準品、原料藥、陰性對照品及供試品溶液，用0.22 μm微孔濾膜過濾上機檢測，標準品和原料藥進樣10 μL，陰性及樣品進樣20 μL，測定，記錄峰面積，即得。

圖5 維生素D3標準品Fig 5 Vitamin D3 standard

圖6 參術(shù)補鈣顆粒維生素D3陰性Figure 6 Vitamin D3 of Shenzhu Calcium Supplem Granule was negative

圖7 參術(shù)補鈣顆粒樣品中維生素D3Fig 7 Vitamin D3 in Shenzhu Calcium Supplem Granule

2.2.2.6 標準曲線的制備 取上述C=100 μg/mL的VD3標準工作液，依次稀釋得到50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL一系列不同濃度的標準品溶液，6個濃度的標準樣分別進樣10 uL，每個平行進兩針，得標準曲線方程y=36300x-9110，r=0.999997，維生素D3在3.125～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2.7 精密度的測定 取上述濃度為25 μg/mL對照品溶液，連續(xù)進樣6次，每次10 μL，考察進樣精密度，RSD為2.20%。

2.2.8 重復性試驗 稱取同一批的參術(shù)補鈣顆粒樣品6份，按照供試品品溶液的制備方法處理，測定樣品中VD3的含量，結(jié)果平均含量為0.03067 μg/g，RSD為3.37%。

2.2.9 回收率的測定 稱取同一批次已知含量的參術(shù)補鈣顆粒(粉碎過60目篩)6份，每份50 g，然后分別按樣品中維生素D3含量的大約80%、100%、120%的量加入維生素D3標準品，再按照供試品溶液的制備方法處理，進樣20 μL，測峰面積。結(jié)果平均回收率為94.83%，RSD為2.77%。

表3 維生素D3回收率的測定Tab 3 Determination of recovery rate of vitamin D3

2.2.10 樣品中維生素D3的含量測定 分別稱取8個不同批次的參術(shù)補鈣顆粒，按照2.2.4項下制備供試品溶液的方法來處理，每個批次平行處理兩份。按照2.2.1項下色譜條件測定，分別進樣20 μL，記錄峰面積，并計算供試品中維生素D3含量。結(jié)果見表2。

表2 不同批次參術(shù)補鈣顆粒中鈣的含量Tab 2 Contents of calcium in different batches of Shenzhu Calcium Supplem Granule

表4 不同批次參術(shù)補鈣顆粒中維生素D3的含量Tab 4 Contents of vitamin D3 in different batches of Shenzhu Calcium Supplem Granule

根據(jù)測定結(jié)果，取8個批次平均含量的80%做為定量限，參術(shù)補鈣顆粒中所含維生素D3的含量定為0.0248 μg/g。

3 討論與結(jié)論

鈣的含量測定方法很多，傳統(tǒng)的EDTA絡(luò)合滴定法樣品用量大，前處理耗時長，終點不易判斷，操作誤差大并且靈敏度不高；高錳酸鉀氧化還原滴定法得到的結(jié)果較準確，終點變化很明顯便于觀察，但操作過程中需要進行沉淀過濾，較為繁瑣[5]；還有離子色譜法、分光光度法?；鹧嬖游辗y定范圍寬[6]、操作簡便、選擇性好、結(jié)果準確可靠，所以實驗中也選用了具有高靈敏度的火焰原子吸收法[7]。該方法操作簡便，樣品無需經(jīng)過消化處理，能測出低含量的鈣且得到結(jié)果的重現(xiàn)性較好，可以用來檢驗多批次的樣品[8]，可用于藥物中鈣的質(zhì)量控制。

雖然已有不少文獻中都采用HPLC法測定保健品以及制劑中維生素D3含量的方法[9-12]，但多用正相色譜檢測且樣品前期處理較為復雜。本課題建立了參術(shù)補鈣顆粒中維生素D3含量測定的反相高效液相色譜法，樣品制備方法簡單，直接用溶劑超聲提取，免去了堿液皂化和反復提取的繁瑣過程，降低了樣品中維生素D3的損失。在檢測過程中采用95%的甲醇作為流動相時，目標峰的保留時間太長；調(diào)整為純甲醇時，出峰時間提前但目標峰與其前面的雜峰無法完全分離；采用98%的甲醇時，目標峰可與雜峰完全分離，保留時間也比用95%甲醇時短。經(jīng)過方法學考察，精密度、重現(xiàn)性、回收率均良好，可用于參術(shù)補鈣顆粒中維生素D3的質(zhì)量控制。

該實驗建立的參術(shù)補鈣顆粒中定性鑒別和定量測定方法簡便、準確、重復性好，可用于參術(shù)補鈣顆粒的質(zhì)量控制。