楊 芳, 姚佳爽, 補(bǔ)姝淳, 孟華穎, 卓 穎
(西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,重慶 400715)
核酸擴(kuò)增技術(shù)是一種可使微量核酸高速擴(kuò)增的技術(shù),自問世以來,被廣泛應(yīng)用于分析生物學(xué)領(lǐng)域。 目前,核酸擴(kuò)增技術(shù)被研究者們不斷改進(jìn), 在生物傳感領(lǐng)域的研究應(yīng)用不斷走向成熟,成為了一種有力的信號放大策略。 常見核酸擴(kuò)增技術(shù)主要有雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)、催化發(fā)夾自組裝(CHA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和核酸剪切酶輔助的放大策略等。HCR 是一個由動力學(xué)因素控制的反應(yīng),具有較高的靈敏度和好的選擇性,并且整個過程操作簡便,不需要酶的參與,可以消除精確控制pH 值、溫度和緩沖介質(zhì)的限制。 在2004 年,Dirks 和Pierce 首次報道HCR 是一種無酶的目標(biāo)物誘導(dǎo)的信號放大策略[1]。 CHA 是另一種無酶的核酸放大策略,其通過DNA 雜交(自組裝和去組裝)而不是鏈?zhǔn)椒磻?yīng)完成的。 具體地講,首先設(shè)計兩個在室溫下能穩(wěn)定共存的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(H1 和H2),然后使用外加的催化分子打破二者的能量平衡形成H1/H2 雙鏈雜交結(jié)構(gòu),同時釋放催化分子并進(jìn)行循環(huán)放大反應(yīng)[2]。 RCA 是一種等溫擴(kuò)增技術(shù),在環(huán)形模板、引物探針和聚合酶的輔助作用下能實現(xiàn)多個互補(bǔ)序列的拷貝,從而在引物探針上延伸并產(chǎn)生一個長的單鏈DNA[3-4]。 一般情況下,線性RCA 可以在短時間內(nèi)實現(xiàn)約103倍的擴(kuò)增, 并且隨著共反應(yīng)物的引入,其擴(kuò)增量還可以進(jìn)一步增加。 因此,RCA 被認(rèn)為是一種高靈敏度、 特異性的核酸放大技術(shù),并且被廣泛應(yīng)用于各種核酸的檢測中[5-7]。在眾多的核酸信號放大策略中,PCR 是一種應(yīng)用最廣泛的DNA 體外擴(kuò)增技術(shù)。 其特點在于,PCR 可實現(xiàn)短時間內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物的指數(shù)級增長[8-9]。 典型的PCR 過程由三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:(1) 高溫條件下模板DNA 的變性;(2) 模板DNA 與引物鏈的退火(復(fù)性);(3)以dNTPs 為反應(yīng)原料,在聚合酶的作用下,引物沿模板延伸;上述三步反應(yīng)組成一個循環(huán), 通過多次循環(huán)反應(yīng),使目標(biāo)DNA 得以迅速擴(kuò)增。 近年來,核酸擴(kuò)增技術(shù)成功應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器的研究工作已得到廣泛報道,所構(gòu)建的生物傳感器的靈敏度不斷提高,甚至達(dá)到單分子檢測水平。 核酸擴(kuò)增技術(shù)的成功應(yīng)用促進(jìn)了生物傳感的發(fā)展同時為更靈敏、高效的生物分子檢測提供了新的思路。
20 世紀(jì)60 年代,Clark和Lyon 首次對生物傳感器的基本概念進(jìn)行了定義[10]。 自此,生物傳感器進(jìn)入人們的視野并迅速發(fā)展起來。 進(jìn)入21世紀(jì),微處理器技術(shù)、計算機(jī)技術(shù)和信息處理技術(shù)的高速發(fā)展使融合了化學(xué)、生物、材料、計算機(jī)等多種學(xué)科知識與技術(shù)的生物傳感器滲透到了環(huán)境保護(hù)、生物工程、疾病診療和食品安全等各個鄰域。 從豌豆雜交理論的提出,到DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn), 生命科學(xué)一直在不斷地進(jìn)步與發(fā)展,科研工作者們對生物體系的探究深入到了分子水平,這對相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷和治療具有重大意義。 然而疾病相關(guān)標(biāo)志物在癌癥早期表達(dá)極低, 人們對分析技術(shù)提出了更高的的要求,使得生物傳感器的發(fā)展面臨著巨大的挑戰(zhàn)。 電化學(xué)發(fā)光生物傳感器(Electrochemiluminescence biosensor) 是以生物活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、DNA/RNA、小分子、離子等作為檢測對象,將特異性識別過程中產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)換為電化學(xué)發(fā)光信號,從而實現(xiàn)對目標(biāo)物定量檢測的分析器件。 它融合了電化學(xué)發(fā)光和生物傳感技術(shù),與其他傳感技術(shù)相比,ECL 傳感技術(shù)具有靈敏度高、背景信號低、可控性高和應(yīng)用范圍廣等特點,是檢測一些低豐度的重要疾病標(biāo)志物,實現(xiàn)疾病早期診斷和治療的可靠平臺。
生物體中的核酸、蛋白質(zhì)、小分子以及離子在復(fù)雜的生命活動中起著至關(guān)重要的作用,它們在生命體中的表達(dá)水平與各種人類疾?。ㄈ鐞盒阅[瘤、心腦血管疾?。┑陌l(fā)生密切相關(guān),因此被廣泛用作相關(guān)疾病的標(biāo)志物[11-12]。 如何實現(xiàn)其高效靈敏的檢測成為了生物分析領(lǐng)域的研究熱點之一。 目標(biāo)物轉(zhuǎn)換策略是通過化學(xué)反應(yīng)或分子間特異性識別作用將少量目標(biāo)物轉(zhuǎn)換成大量模擬目標(biāo)物的一種信號放大技術(shù)。 它的出現(xiàn)和應(yīng)用為疾病標(biāo)志物的分析提供了高靈敏檢測手段,在疾病標(biāo)志物痕量分析中占據(jù)重要地位[13-16]。
核酸是由許多核苷酸聚合成的生物大分子化合物,為生命的最基本物質(zhì)之一,根據(jù)化學(xué)組成不同,核酸可分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。 目前,核酸檢測的主要方式是利用堿基互補(bǔ)配對原則。 在目標(biāo)核酸存在時,其與相應(yīng)核酸經(jīng)過識別互補(bǔ)誘導(dǎo)核酸擴(kuò)增或DNA 自組裝,之后,少量靶標(biāo)核酸分子轉(zhuǎn)換成與ECL 信號相關(guān)聯(lián)的模擬目標(biāo)物,以此實現(xiàn)目標(biāo)核酸的檢測。
He 等[17]通過改善自組裝單鏈DNA 探針的位置分布和空間取向, 提高了超支化滾環(huán)擴(kuò)增(HRCA)的效率,實現(xiàn)了目標(biāo)物的高效轉(zhuǎn)換(圖1)。 當(dāng)靶DNA 存在時,HRCA 反應(yīng)啟動并快速積累了大量的擴(kuò)增產(chǎn)物,這些擴(kuò)增產(chǎn)物含有不同長度的雙鏈DNA(dsDNA)片段,然后大量的Ru(Phen)32+作為ECL 指示劑插入dsDNA 片段的溝槽中,輸出強(qiáng)的ECL 信號。因此,ECL 信號與擴(kuò)增產(chǎn)物的量呈正相關(guān), 從而實現(xiàn)靶DNA 的靈敏檢測。 該傳感器的檢測線低至7.6 fmol/L。
圖1 檢測HPV16 DNA 的ECL 生物傳感器示意圖[17]Fig.1 Mechanism of the ECL biosensor for detecting HPV16 DNA.Coptright 2021 ACS
近年來,隨著DNA 納米技術(shù)的發(fā)展,DNA 步行器(walker)因其可自主運行、方向性強(qiáng)、可編程性等特點成為了信號放大技術(shù)的寵兒。 Nie 等[18]以DNA walker 作為信號放大技術(shù)實現(xiàn)了目標(biāo)物的高效轉(zhuǎn)換和檢測。 如圖2 所示,首先將封鎖的DNA walker 固定在電極表面, 當(dāng)目標(biāo)DNA 存在時,目標(biāo)物與封鎖鏈互補(bǔ)雜交,此時,目標(biāo)DNA轉(zhuǎn)化成了DNA walker, 隨后DNA walker 在電極表面行走促使ECL 指示劑離開電極表面。檢測過程中,ECL 信號與目標(biāo)物的量呈負(fù)相關(guān), 以此實現(xiàn)目標(biāo)物的轉(zhuǎn)換和檢測。 另外,Lv 等[19]使用目標(biāo)DNA 與兩條DNA 鏈(WD1 和WD2)雜交將目標(biāo)物轉(zhuǎn)換成雙足DNA walker,隨后雙足DNA walker行走在規(guī)則的DNA 軌道上, 它可以有效地提高DNA walker 的行走效率,從而快速取代猝滅探針點亮ECL 信號,實現(xiàn)目標(biāo)物的信號放大。 該傳感器檢測限低至0.18 fmol/L(圖3)。
圖2 基于DNA walker 檢測HPV16 DNA 的ECL 生物傳感器示意圖[18]Fig.2 Schematic diagram of DNA walker-based ECL biosensor for HPV16 DNA detection.Coptright 2020 Elsevier
圖3 基于雙足DNA walkerBCR/ABL 融合基因的ECL 生物傳感器示意圖[19]Fig.3 Schematic diagram of bipedal DNA walker-based ECL biosensor for BCR/ABL fusion gene detection.Coptright 2020 ACS
Micro RNA(miRNA)是一類在多種真核生物中調(diào)控基因表達(dá)的小型非編碼RNA[20]。 研究表明,miRNA 參與多種生命活動過程, 包括癌細(xì)胞的生長、分化、凋亡等[21-22],是現(xiàn)代分子生物學(xué)用于鑒定多種生物學(xué)和病理學(xué)過程的重要標(biāo)志物之一。 Jiang 等[23]設(shè)計了一種新型的DNA 納米機(jī)器用于高效的靶標(biāo)轉(zhuǎn)換并將其用于構(gòu)建miRNA-21 超靈敏檢測的ECL 生物傳感器。 如圖4 所示,在miRNA-21 存在下,由于局域效應(yīng),它引發(fā)了定位DNA 級聯(lián)反應(yīng)(LDCR)并轉(zhuǎn)換成大量模擬目標(biāo)物(二茂鐵標(biāo)記的DNA,F(xiàn)c-DNA)?;贓CL材料與Fc 之間的能量和電子轉(zhuǎn)移,F(xiàn)c 可以有效地猝滅發(fā)光體的ECL 強(qiáng)度,從而實現(xiàn)對miRNA-21 的靈敏檢測。該生物傳感器表現(xiàn)出寬的檢測范圍 (100 amol/L~1 nmol/L) 和低的檢測限(10.7 amol/L)。
圖4 (A)DNA 納米機(jī)器的組裝及目標(biāo)物的轉(zhuǎn)換,(B)ECL 傳感器的制備[23]Fig.4 (A)the assembly of DNA nanomachine and target conversion,(B)the preparation of ECL biosensor.Copyright 2019 ACS
Liu 等[24]以紅熒烯納米棒為發(fā)光試劑,以溶解氧為共反應(yīng)試劑構(gòu)建了microRNA-141 生物傳感器,具體過程如圖5 所示。 值得一提的是,該體系以少量的目標(biāo)物驅(qū)動酶輔DNA 循環(huán)放大,輸出大量的鉑納米粒子修飾的DNA 短鏈(S1/PtNPs)作為模擬目標(biāo)物,構(gòu)建了“on-off-super on”的信號轉(zhuǎn)換模式,為ECL 生物傳感平臺開辟了新的研究方向。
圖5 生物傳感器制備過程示意圖[24]Fig.5 Schematic illustration of fabrication of the biosensor
除此之外,Liao 等[25]設(shè)計了外切酶III(Exo III)輔助的級聯(lián)放大策略實現(xiàn)了目標(biāo)物的雙重轉(zhuǎn)換。 在EXO Ⅲ的輔助下,少量的靶miRNA-21 觸發(fā)級聯(lián)信號放大并被轉(zhuǎn)換成大量的次級靶目標(biāo)物(T2)。 然后T2 能夠打開修飾在電極表面的發(fā)夾DNA1 鏈。 隨后, 引入DNA2 和DNA3 觸發(fā)HCR 過程,形成大量富含AT 的dsDNA。 最后,將Cu2+與富含AT 的dsDNA 孵育后,由于A-Cu2+-T鍵的作用, 在dsDNA 上原位生成了dsDNA 固定的Cu NCs, 從而獲得強(qiáng)的ECL 信號, 實現(xiàn)miRNA-21 的靈敏檢測 (圖6, 檢測限為19.05 amol/L)。
圖6 Exo III 輔助的目標(biāo)物雙重轉(zhuǎn)換[25]Fig.6 Exo III-assisted double conversion of target.Copyright 2018 Elsvier
不同于核酸標(biāo)志物,蛋白質(zhì)、離子和小分子等非核酸標(biāo)志物無法通過堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行識別,進(jìn)而不能實現(xiàn)目標(biāo)物的轉(zhuǎn)換便無法達(dá)到靈敏檢測的目的。 但研究者們通過不斷的探索,開發(fā)了適用于非核酸標(biāo)志物的轉(zhuǎn)換策略以實現(xiàn)其靈敏檢測。 目前,主要通過特異性的生物識別(抗原抗體反應(yīng)和核酸適配體結(jié)合) 或物質(zhì)之間的化學(xué)反應(yīng)構(gòu)建非核酸目標(biāo)物的轉(zhuǎn)換策略。
Lei 等[26]設(shè)計了一種智能的環(huán)形肽-DNA 納米機(jī)器實現(xiàn)了抗體的轉(zhuǎn)換和信號放大。 首先,將特異性抗原肽核酸序列與DNA 鏈交聯(lián)形成捕獲探針(CP),在靶巨細(xì)胞病毒pp65 抗體(anti-CMV pp65) 存在時,CP 特異性識別抗體并通過DNA鄰位觸及作用形成一個智能的環(huán)形肽-DNA 納米機(jī)器。 然后,在聚合酶和剪切酶的輔助下,環(huán)形肽-DNA 納米機(jī)器可以引發(fā)后續(xù)的級聯(lián)放大,從而輸出大量的模擬目標(biāo)物。 最后,模擬目標(biāo)物與電極表面的猝滅探針雜交, 使體系的ECL 恢復(fù)。該傳感器的靈敏度低至0.33 fmol/L(圖7)。
圖7 巨細(xì)胞病毒pp65 抗體的轉(zhuǎn)換及檢測原理示意圖[26]Fig.7 Schematic of the conversion and detection principle of anti-CMV pp65.Copyright 2018 ACS
Jiang 等[27]通過核酸適體結(jié)合將靶蛋白MUC1轉(zhuǎn)換成MUC1-適體復(fù)合物 (MUC1-A), 隨后MUC1-A 觸發(fā)催化發(fā)夾自組裝(CHA)反應(yīng),使得標(biāo)記有發(fā)光體ABEI 的DNA 鏈固定在CoFe2O4材料表面。 最后,電極表面的S1 鏈捕獲S2 修飾的CoFe2O4產(chǎn)生強(qiáng)的ECL 信號。 該傳感器的檢測范圍為1 fg/mL~1 ng/mL, 檢測限低至0.62 fg/mL(圖8)。
圖8 (A)目標(biāo)物MUC1 的轉(zhuǎn)換策略,(B)ECL 生物傳感的構(gòu)建[27]Fig.8 (A)Target MUC1 conversion by protein-aptamer binding complex,(B)the construction of the ECL biosensor.Copyright 2017 ACS
Zhao 等[28]利用核酸適配體識別內(nèi)毒素(LPS)引起二級結(jié)構(gòu)的變化, 然后觸發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增(RCA), 隨著RCA 的進(jìn)行,LPS 又被釋放出來觸發(fā)下一循環(huán), 從而實現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)同步RCA 信號放大策略。利用RCA 產(chǎn)生的富G 堿基DNA 序列與卟啉鐵, 形成卟啉鐵/G-四鏈體核脫氧核糖核酸酶(hemin/G-quadruplex DNAzymes)可以有效地猝滅MoS2量子點/TPrA 體系的ECL 信號,從而實現(xiàn)了對LPS 的高靈敏檢測(如圖9 所示)。由于目標(biāo)物循環(huán)與RCA 同步進(jìn)行, 簡化了檢測操作的同時,還有效地提高了信號放大效率。 該ECL 適體傳感器展現(xiàn)出寬的檢測范圍0.1 fg/mL~50 ng/mL,檢測限低至0.07 fg/mL。
圖9 基于目標(biāo)物循環(huán)同步滾環(huán)擴(kuò)增的ECL 適體傳感器用于LPS 檢測的原理示意圖[28]Fig.9 (A)Schematic illustration of the ultrasensitive “onoff”ECL aptasensor for LPS Detection based on aptamer recognition-driven target-cycling synchronized RCA:(A)Preparation process of MoS2@Pd-Au.Copyright 2017 ACS
同樣,利用核酸適體結(jié)合,Lei 等[29]實現(xiàn)了Hg2+的特異性檢測。 目標(biāo)Hg2+的引入能夠使富含胸腺嘧啶(T 堿基)的柔性單鏈通過特異性的THg2+-T 作用折疊形成“duplicator-like”的DNA 機(jī)器, 隨后在酶的輔助下引發(fā)鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)將Hg2+轉(zhuǎn)換成大量的模擬目標(biāo)物。 產(chǎn)生的模擬目標(biāo)物進(jìn)一步在電極表面上引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得到富鳥嘌呤(C 堿基)的長的DNA 片段,該片段能夠通過C-Ag+-C 作用富集Ag+。Ag+作為共反應(yīng)促進(jìn)劑能夠增強(qiáng)PTCA/S2O82-體系的ECL 信號強(qiáng)度,從而實現(xiàn)對Hg2+的靈敏檢測(圖10,檢測限低至0.33 fmol/L)。
圖10 Hg2+的轉(zhuǎn)換策略和ECL 傳感器的構(gòu)建[29]Fig.10 Target Hg2+conversion by SDA and the construction of the ECL biosensor.Copyright 2018 ACS
除了T-Hg2+-T、C-Ag+-C 這一類固定堿基與金屬離子的特異性結(jié)合之外,一些特定核酸序列在存在相匹配的金屬離子時, 能夠激活酶活性,即所謂的核酶(ribozyme)/脫氧核酶(DNzyme)。利用這些酶的活性,可以將金屬離子的濃度信息轉(zhuǎn)化為核酸信號,并通過DNA 信號放大策略,實現(xiàn)金屬離子的高靈敏檢測。 Lei 等[30]利用Cu2+激活的DNzyme 剪切DNA 的活性, 構(gòu)建了ECL 生物傳感器實現(xiàn)Cu2+的超靈敏檢測。具體原理如圖11所示, 脫氧核酶DNA 與標(biāo)記有猝滅探針的底物DNA 的復(fù)合物通過自組裝修飾在電極界面,Cu2+的存在能夠激活DNA 剪切,將底物DNA 剪切為兩段DNA 片段,從而使猝滅探針離開電極界面,而Cu2+能夠進(jìn)入下一循環(huán)繼續(xù)剪切其它底物DNA 并釋放猝滅探針,從而實現(xiàn)對Cu2+的信號放大。 最終, 大量的ECL 猝滅探針離開電極界面,ECL 信號完成off-on 的轉(zhuǎn)換, 由于DNA 信號放大的作用,該ECL 生物傳感器對Cu2+檢測的靈敏度顯著提高,檢測限低至0.34 pmol/L。
圖11 PTCA-S2O82-體系應(yīng)用于ECL 生物傳感器用于Cu2+的原理示意圖[30]Fig.11 Schematic illustration of the preparation procedure of the Cu2+-specific DNAzyme‐based ECL biosensor for Cu2+detection
盡管核酸適配體展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用前景,但它的篩選過程復(fù)雜,人力、財力和時間耗費大,篩選的成功率不盡如人意。 因此,目前有效可用的核酸適配體還非常有限,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床及市場上的需要。 最近,研究者們提出了將特異識別位點標(biāo)記到核酸分子,基于此實現(xiàn)抗體蛋白的目標(biāo)物轉(zhuǎn)換與靈敏檢測。 如圖12 所示,Yang 等[31]報道了一個將抗地高辛球蛋白(anti-Dig)通過抗體驅(qū)動的三聯(lián)DNA 納米機(jī)器轉(zhuǎn)換為DNA 鏈,從而進(jìn)一步參與酶驅(qū)動的鏈置換循環(huán)反應(yīng),以獲得傳感器的ECL 信號放大,成功地實現(xiàn)了目標(biāo)蛋白anti-Dig 的檢測,其檢測限為6.7 pmol/L。
圖12 anti-Dig 檢測過程的示意圖[31]Fig.12 Schematic illustration of production process for sensitive detection of anti-Dig
如圖13 所示,Ge 等[32]基于谷胱甘肽(GSH)與MnO2之間的氧化還原反應(yīng)將GSH 轉(zhuǎn)換為Mn2+。 然后,Mn2+作為模擬目標(biāo)物觸發(fā)DNAzyme輔助的循環(huán)擴(kuò)增。 之后, 擴(kuò)增產(chǎn)物S3 激活DNA分子機(jī)器并在剪切酶的輔助下使H1 發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變形成了大量的鏈霉親和素(SA)適配體。 最后,SA 適配體與標(biāo)記有SA 的發(fā)光體特異性識別輸出強(qiáng)的ECL 信號。該生物傳感器表現(xiàn)出優(yōu)異的檢測性能 (檢測范圍為1~200 μmol/L, 檢測限為0.44 μmol/L)。
圖13 (A)GSH 的轉(zhuǎn)換策略,(B)模擬目標(biāo)物Mn2+觸發(fā)DNAzyme 輔助的循環(huán)擴(kuò)增,(C)傳感器的檢測原理[32]Fig.13 (A)The conversion of GSH,(B)Mn2+-Induced DNAzyme Recycling Amplification,(C)the work principle of biosensor.Copyright 2019 ACS
ECL 生物傳感器在生物分子檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出獨特的優(yōu)越性和廣闊的應(yīng)用前景,受到研究人員的廣泛關(guān)注,已逐漸成為當(dāng)前生命分析領(lǐng)域的研究熱點。 隨著更多核酸擴(kuò)增的目標(biāo)物轉(zhuǎn)換策略的提出和納米技術(shù)的發(fā)展,高靈敏和高特異性生物傳感器被逐漸開發(fā)和應(yīng)用。 雖然核酸擴(kuò)增技術(shù)推動了ECL 生物傳感的發(fā)展和革新,但在大多數(shù)情況下,ECL 傳感檢測的對象僅限于體外樣品,無法靈敏準(zhǔn)確獲取細(xì)胞內(nèi)一些生物分子的信息。 今后,性能更穩(wěn)定、功能更多樣、普適性更高的核酸擴(kuò)增技術(shù)的設(shè)計以及微型化、 多通量的ECL 生物傳感器的開發(fā)將會是傳感領(lǐng)域的研究發(fā)展方向。