鄒欣蓉，謝 宇，龍立慧，羅鈺梅，張玲貞，張洪友，張麗艷*

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州廣濟(jì)堂藥業(yè)有限公司，貴州 貴陽 550014)

丹參是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究較多的傳統(tǒng)中藥材之一，為唇形科(Labiatae)鼠尾草屬丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖[1]。丹參最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主產(chǎn)于河北、四川、山東等地，在我國有近2 000年的應(yīng)用歷史[2]。丹參廣泛用于治療各種瘀血所致的病癥，有活血化瘀、除煩安神等功效[3]，是一種常用的活血化瘀藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)及臨床應(yīng)用表明，丹參不僅在活血化瘀方面有很好的療效，還在改善心腦血管疾病、抗腫瘤、抗氧化等方面具有良好的藥理作用[4-5]。

超微粉碎技術(shù)在20世紀(jì)末開始應(yīng)用于中藥行業(yè)，破壁飲片是繼單味浸膏顆粒后出現(xiàn)的一類新型中藥飲片。破壁飲片是可供直接口服的粉末中藥飲片，是傳統(tǒng)飲片利用現(xiàn)代超微粉碎技術(shù)粉碎加工為D90<45 μm(300目以上)的粉體[6]。本研究使用的丹參普通破壁飲片、冷凍破壁飲片分別經(jīng)普通球磨破壁機(jī)、冷凍球磨粉碎機(jī)超微粉碎加工而成。與傳統(tǒng)飲片相比，破壁飲片具有以下優(yōu)點(diǎn)：①成分與傳統(tǒng)飲片一致；②提高藥材活性物質(zhì)利用率和提取率；③攜帶、服用方便；④提高中藥質(zhì)量可控性等[7-9]。

目前，丹參破壁飲片的研究涉及工藝、質(zhì)量、安全、有效性以及臨床應(yīng)用等方面。本研究旨在建立丹參傳統(tǒng)飲片、普通破壁飲片和冷凍破壁飲片中的脂溶性代表成分丹參酮ⅡA和水溶性代表成分丹酚酸B的薄層鑒別方法，分析不同加工方式丹參飲片的差異，為丹參破壁飲片安全、合理、有效地應(yīng)用和生產(chǎn)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥

10批樣品為從不同省市零售藥店或飲片公司購得的丹參飲片，所有樣品均經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)植物栽培教研室魏升華教授鑒定為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖。每批丹參樣品隨機(jī)分為3份，一份經(jīng)實(shí)驗(yàn)粉碎機(jī)粉碎過2號(hào)篩為傳統(tǒng)飲片，一份經(jīng)普通球磨破壁機(jī)超微粉碎直至D90<45 μm為普通破壁飲片，另一份由冷凍球磨粉碎機(jī)超微粉碎至D90<45 μm為冷凍破壁飲片。其中，破壁飲片由貴州廣濟(jì)堂藥業(yè)有限公司提供。藥材來源信息見表1。

表1 丹參藥材來源

1.2 儀器

KQ5200DE超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；JP2-160電子分析天平(日本)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海浦東物理光學(xué)儀器廠)；ZF7紫外分析儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.3 試劑

硅膠G(批號(hào)：20180601，青島鼎康硅膠有限公司)；硅膠GF254(批號(hào)：20180619，青島鼎康硅膠有限公司)；丹酚酸B(批號(hào)：11907227)、 丹參酮ⅡA(批號(hào)：110766-201721)、丹參對(duì)照藥材(批號(hào)：120923-201615)均購于中國食品藥品檢定研究院；甲苯、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、甲酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA供試品及對(duì)照品溶液制備

供試品溶液：精密稱取丹參傳統(tǒng)飲片、普通破壁飲片、冷凍破壁飲片藥材粉末各1 g，分別置錐形瓶中，各加乙酸乙酯8 mL，用超聲提取30 min后濾過，濾液水浴蒸干，再加入乙酸乙酯1 mL使其溶解，作為供試品溶液。

丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液：取丹參酮ⅡA對(duì)照品適量，精密稱定，加乙酸乙酯制成約1 mg·mLkg-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.1 傳統(tǒng)飲片丹參酮ⅡA的TLC鑒別 吸取上述對(duì)照品溶液和傳統(tǒng)飲片供試品溶液各5 μL。根據(jù)薄層色譜法2015年版《中國藥典》四部通則0502試驗(yàn)，以甲苯-乙酸乙酯(19∶3)為展開系統(tǒng)，分別依次點(diǎn)樣于同一硅膠G板上，展開，取出，晾干，在日光下觀察。結(jié)果顯示，在薄層色譜圖中，丹參傳統(tǒng)飲片樣品，對(duì)照品和對(duì)照藥材在相應(yīng)位置出現(xiàn)了顏色相同的斑點(diǎn)，色譜行為基本一致，如圖1所示。

注：1.丹參酮ⅡA對(duì)照品；2.丹參對(duì)照藥材；3～12.樣品。

2.1.2 普通破壁飲片丹參酮ⅡA的TLC鑒別 吸取上述對(duì)照品溶液和普通破壁飲片供試品溶液各7 μL。根據(jù)薄層色譜法2015年版《中國藥典》四部通則0502試驗(yàn)，以甲苯-乙酸乙酯(19∶3)為展開系統(tǒng)，分別依次點(diǎn)樣于同一硅膠G板上，展開，取出，晾干，在日光下觀察。結(jié)果顯示，在薄層色譜圖中，丹參普通破壁飲片樣品，對(duì)照品和對(duì)照藥材在相應(yīng)位置出現(xiàn)了顏色相同的斑點(diǎn)，色譜行為基本一致，如圖2所示。

注：1.丹參酮ⅡA對(duì)照品；2.丹參對(duì)照藥材；3～12.樣品

2.1.3 冷凍破壁飲片丹參酮ⅡA的TLC鑒別 吸取上述對(duì)照品溶液、冷凍破壁飲片供試品溶液各7 μL。根據(jù)薄層色譜法2015年版《中國藥典》四部通則0502試驗(yàn)，以甲苯-乙酸乙酯(19∶3)為展開系統(tǒng)，分別依次點(diǎn)樣于同一硅膠G板上，展開，取出，晾干，在日光下觀察。結(jié)果顯示，在薄層色譜圖中，丹參冷凍破壁飲片樣品，對(duì)照品和對(duì)照藥材在相應(yīng)位置出現(xiàn)了相同顏色的斑點(diǎn)，色譜行為基本一致，如圖3所示。

注：1.丹參酮ⅡA對(duì)照品；2.丹參對(duì)照藥材；3～12.樣品。

2.2 丹酚酸B供試品及對(duì)照品溶液制備

供試品溶液：精密稱取丹參藥材傳統(tǒng)飲片、普通破壁飲片、冷凍破壁飲片藥材粉末各0.2 g，分別置圓底燒瓶中加入75%甲醇25 mL，加熱水浴回流1 h，過濾，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。

丹酚酸B對(duì)照品溶液：稱取丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加75%甲醇制成濃度為1 mg·mLkg-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.1 傳統(tǒng)飲片丹酚酸B的TLC鑒別 吸取對(duì)照品溶液、傳統(tǒng)飲片供試品溶液各5 μL。根據(jù)薄層色譜法2015年版《中國藥典》四部通則0502試驗(yàn)，依次點(diǎn)樣于同一硅膠GF254板上，以甲苯-乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-甲酸(2∶4∶3∶0.5∶2)為展開系統(tǒng)，展開，取出，晾干，置紫外燈(254 nm)下觀察。結(jié)果顯示，在薄層色譜圖中，丹參傳統(tǒng)飲片樣品，對(duì)照品和對(duì)照藥材在相應(yīng)位置出現(xiàn)了顏色相同的斑點(diǎn)，其色譜行為基本一致，如圖4所示。

注：1.丹酚酸B對(duì)照品；2.丹參對(duì)照藥材；3～12.樣品。

2.2.2 普通破壁飲片丹酚酸B的TLC鑒別 吸取對(duì)照品溶液、普通破壁飲片供試品溶液各5 μL。根據(jù)薄層色譜法2015年版《中國藥典》四部通則0502試驗(yàn)，依次點(diǎn)樣于同一硅膠GF254板上，以甲苯-乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-甲酸(2∶4∶3∶0.5∶2)為展開系統(tǒng)，展開，取出，晾干，置紫外燈(254 nm)下觀察。結(jié)果顯示，在薄層色譜圖中，丹參普通破壁飲片樣品，對(duì)照品和對(duì)照藥材在相應(yīng)位置出現(xiàn)了相同顏色的斑點(diǎn)，色譜行為基本一致，如圖5所示。

2.2.3 冷凍破壁飲片丹酚酸B的TLC鑒別 吸取對(duì)照品溶液、冷凍破壁飲片供試品溶液各5 μL。根據(jù)薄層色譜法2015年版《中國藥典》四部通則0502試驗(yàn)，分別依次點(diǎn)樣于同一硅膠GF254板上，以甲苯-乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-甲酸(2∶4∶3∶0.5∶2)為展開系統(tǒng)，展開，取出，晾干，置紫外燈(254 nm)下觀察。結(jié)果顯示，在薄層色譜圖中，丹參冷凍破壁飲片樣品，對(duì)照品和對(duì)照藥材在相應(yīng)位置出現(xiàn)了相同顏色的斑點(diǎn)，色譜行為基本一致，如圖6所示。

注：1.丹酚酸B對(duì)照品；2.丹參對(duì)照藥材；3～12.樣品。

注：1.丹酚酸B對(duì)照品；2.丹參對(duì)照藥材；3～12.樣品。

3 討論

本研究對(duì)丹參傳統(tǒng)飲片、普通破壁飲片、冷凍破壁飲片中丹參酮ⅡA的提取溶劑和展開體系進(jìn)行了考察，分別以乙酸乙酯和甲醇為溶劑，結(jié)果顯示用乙酸乙酯提取的樣品斑點(diǎn)較清晰圓整；通過對(duì)展開劑進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn)，以甲苯-乙酸乙酯(19∶3)為展開系統(tǒng)可得到分離度較好、清晰圓整、明顯的斑點(diǎn)。同時(shí)，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)丹參傳統(tǒng)飲片、普通破壁飲片、冷凍破壁飲片的丹參酮ⅡA薄層鑒別，在相同點(diǎn)樣量條件下普通破壁飲片和冷凍破壁飲片的斑點(diǎn)不清晰，故加大點(diǎn)樣量使斑點(diǎn)清晰、明顯，最終確定傳統(tǒng)飲片點(diǎn)樣量為5 μL，普通破壁飲片和冷凍破壁飲片點(diǎn)樣量均為7 μL，提示破壁飲片中的脂溶性成分丹參酮ⅡA可能被破壞。

丹參傳統(tǒng)飲片、普通破壁飲片、冷凍破壁飲片中丹酚酸B的薄層鑒別研究通過對(duì)提取方法和展開體系進(jìn)行考察，結(jié)果顯示回流提取法和超聲提取法兩種提取法斑點(diǎn)數(shù)相同，目標(biāo)點(diǎn)位置相同，但回流提取的樣品更加穩(wěn)定，故提取方法選擇回流提取法；展開劑以甲苯-乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-甲酸(2∶4∶3∶0.5∶2)得到圓整清晰、分離度較好的斑點(diǎn)。丹參傳統(tǒng)飲片、普通破壁飲片、冷凍破壁飲片中丹酚酸B的薄層鑒別結(jié)果顯示，三種飲片點(diǎn)樣量相同時(shí)，得到的色譜斑點(diǎn)個(gè)數(shù)、顏色、位置基本一致，由此可以初步確定，丹參經(jīng)破壁處理后其丹酚酸B含量無明顯變化。

有關(guān)實(shí)驗(yàn)研究顯示，丹參酮ⅡA易受光照和溫度的影響，在日光和高溫條件下可發(fā)生降解反應(yīng)而使含量降低[10-11]，而丹酚酸B較穩(wěn)定[12]，在破壁過程中造成了脂溶性成分丹參酮ⅡA含量降低，而丹酚酸B無明顯變化，可能是由于丹參酮ⅡA本身穩(wěn)定性較差，也可能是受破壁過程中物料產(chǎn)熱等因素的影響。因此，今后需對(duì)丹參破壁工藝進(jìn)行深入研究，以實(shí)現(xiàn)丹參破壁飲片安全、合理、有效地生產(chǎn)和應(yīng)用。