宿進(jìn)江,張春斌，陳曉杭,李冬雪,羅小金,楊潔霞,尹愛華,高玉山,魏鳳香

(1.黑龍江省佳木斯市佳木斯大學(xué)生物學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 154007； 2.廣東省深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518172； 3.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563006； 4.廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東廣州 510000； 5.廣州婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，廣東 廣州 510000； 6.深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院產(chǎn)科，廣東 深圳 518172)

許多家庭隨我國二胎政策的實(shí)施紛紛選擇生育二胎，其中不乏年齡較大的孕婦，而高齡孕婦(35歲以上)隨年齡的增長(zhǎng)易出現(xiàn)染色體異常，其中唐氏綜合征患者高達(dá)2%。染色體疾病大多是由染色體異常所導(dǎo)致，而染色體異常是導(dǎo)致胎兒復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及出生缺陷的主要因素，其中染色體非整倍體占首要地位，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]。目前，針對(duì)高危孕婦可通過羊膜腔穿刺、臍血管穿刺等介入性手段進(jìn)行胎兒細(xì)胞染色體核型分析，可有效診斷非整倍體[2-3]。但由于檢測(cè)時(shí)間窗窄、診斷周期較長(zhǎng)，需要更早期、快速、精準(zhǔn)的分析方法。近年來,隨著蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展成熟，應(yīng)用多肽質(zhì)譜檢測(cè)不同類型疾病的多肽表達(dá)差異，為非整倍體診斷和預(yù)后標(biāo)志物篩選提供了新思路[4-5]。因此，本研究應(yīng)用國產(chǎn)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)(Clin-TOF質(zhì)譜系統(tǒng))分析正常對(duì)照組及非整倍體組胎兒羊水多肽表達(dá)是否存在差異并建立理想模型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床病例資料

收集2015年6月至2016年6月期間來深圳市龍崗婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷的三體胎兒羊水樣本96例，根據(jù)染色體核型分析結(jié)果將其分為50例正常對(duì)照組，46例21、18、XXY、XYY 、X 5種染色體非整倍體組。所有孕婦均已簽署知情同意書。具體病例資料見表1。

1.2 樣本采集和預(yù)處理

經(jīng)超聲引導(dǎo)下穿刺抽取孕婦羊水5 mL，4 ℃ 3 500 r/min離心10 min。將羊水按照500 μL/離心管分裝，放入-80 ℃冰箱短期保存，避免反復(fù)凍融。

表1 正常對(duì)照組和非整倍體組臨床信息

1.3 試劑

弱陽離子磁珠試劑盒購自毅新興業(yè)(北京)科技有限公司。

1.4 主要儀器

Clin-TOF-Ⅱ質(zhì)譜系統(tǒng)分析平臺(tái)(北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司)。

1.5 磁珠法提取多肽

樣本多肽提取過程參見文獻(xiàn)[6]。

1.6 Clin-TOF-II質(zhì)譜分析

取1 μL多肽洗脫液樣品滴在ClinTOF靶板上，自然晾干，再取1 μL基質(zhì)覆蓋到樣品上，自然晾干。校正儀器，進(jìn)行樣品檢測(cè)。每例樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，獲得原始的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為.txt格式的文件導(dǎo)入到BioExplorer軟件，對(duì)于每例樣品的3個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)求得算數(shù)平均后即得到了該例樣品的信號(hào)處理數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)于BioExplorer處理后數(shù)據(jù)主要進(jìn)行了t檢驗(yàn)、ANOVA檢驗(yàn)(f檢驗(yàn))、 Wilcoxon檢驗(yàn)、Krμskal-Wallis檢驗(yàn)及Anderson-Darling檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于不同的分組分別進(jìn)行確切概率Fisher、K-近鄰KNN、線性支持向量機(jī)Linear SVM、徑向基函數(shù)網(wǎng)絡(luò)RBF等模型。

2 結(jié)果

2.1 羊水多肽質(zhì)譜圖的檢測(cè)

96 例信號(hào)處理數(shù)據(jù)的原始質(zhì)譜圖如圖1A和1C所示。對(duì)原始圖譜中存在的化學(xué)噪音和電信號(hào)噪音需在進(jìn)行分析前通過數(shù)據(jù)校正和歸一化等消除噪音。處理結(jié)果如圖1B和1D所示。后文所有的分析是建立在96例信號(hào)處理數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上。

2.2 正常對(duì)照組與非整倍體組多肽組學(xué)表達(dá)差異

對(duì)于處理后的96例數(shù)據(jù)進(jìn)行了t檢驗(yàn)、ANOVA檢驗(yàn)、Wilcoxon 檢驗(yàn)、Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)及Anderson-Darling 檢驗(yàn)等相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后，得到124個(gè)差異多肽峰，其中顯著性差異多肽峰95個(gè)，極顯著性差異多肽峰29個(gè)。前10名極顯著差異多肽峰列表如表2所示。其中2 245.8m/z多肽峰和1 028.7m/z多肽峰差異重現(xiàn)性最好，2 245.8m/z多肽峰和1 028.7m/z多肽峰峰值位點(diǎn)分別如圖2、圖3所示。所有樣本在這2個(gè)差異峰上的分布如圖4所示。

注： 正常對(duì)照組原始(A)及處理后(B)質(zhì)譜圖；非整倍體組原始(C)及處理后(D)質(zhì)譜圖。

表2 2 245.8 m/z和1 028.7 m/z多肽峰極顯著差異多肽峰列表 Table 2 List of significantly differentiated peptide peaks

圖2 62號(hào)差異峰位點(diǎn)-峰值圖Figure 2 Site-to-peak plot of difference peak 62

圖3 3號(hào)差異峰位點(diǎn)-峰值圖Figure 3 Site-to-peak plot of difference peak 3

圖4 正常對(duì)照組和非整倍體組在差異峰上的分布

2.3 非整倍體組多肽組學(xué)診斷模型的建立及驗(yàn)證

根據(jù)極顯著差異多肽峰2 245.8m/z和1 028.7m/z，對(duì)于正常對(duì)照組和非整倍體組進(jìn)行模型建立，并計(jì)算模型的準(zhǔn)確率如表3所示。4種模型中，RBF模型能較為準(zhǔn)確地區(qū)分正常對(duì)照和非整倍體。

表3 根據(jù)2 245.8 m/z和1 028.7 m/z多肽峰建立分組模型Table 3 Establishment of models based on 2 245.8 m/z and 1 028.7 m/z peptide peaks

3 討論

非整倍體是產(chǎn)前診斷最常見的染色體數(shù)目異常類疾病，其中21、18、13三體會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的胎兒結(jié)構(gòu)異常和智力障礙等，性染色體數(shù)目異?？蓪?dǎo)致患兒不育和發(fā)育異常[7-9]。針對(duì)非整倍體盡早篩查診斷，有利降低出生缺陷，提高全民身體素質(zhì)。羊水作用之一是調(diào)節(jié)胎兒與母體的動(dòng)態(tài)平衡，它包含的每一種蛋白質(zhì)和小分子多肽表達(dá)均能反映胎兒的生理或病理狀態(tài)，一旦胎兒在整個(gè)懷孕期間出現(xiàn)異常，這種平衡就會(huì)被破壞[10]。因此，為了孕婦母體及胎兒的健康，尋找這種蛋白質(zhì)或多肽的失衡，有助于疾病的早期發(fā)現(xiàn)。多肽質(zhì)譜技術(shù)除了應(yīng)用于產(chǎn)前診斷篩查外，主要集中在羊膜過早破裂的檢測(cè)和羊膜內(nèi)感染的診斷上[11-13]。但到目前并未找到更為廉價(jià)且診斷率高的差異性蛋白作為產(chǎn)前診斷的特異標(biāo)志物。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)直接以蛋白質(zhì)為切入點(diǎn)在整體水平上研究差異性蛋白質(zhì)功能的調(diào)控規(guī)律，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，可高效地捕獲體液中的小分子和低豐度蛋白，并對(duì)篩選出的差異性蛋白或多肽進(jìn)行序列鑒定[14]。本研究應(yīng)用Clin-TOF-Ⅱ質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)非整倍體胎兒羊水進(jìn)行初步多肽質(zhì)譜分析。對(duì)96例羊水樣本進(jìn)行質(zhì)譜分析，如圖1可知，去噪音處理后的圖像與原始圖相比，峰值集中，波動(dòng)穩(wěn)定。結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，得到124個(gè)差異多肽峰，其中顯著性差異多肽峰95個(gè)，極顯著性差異多肽峰29個(gè)。由此可知，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，差異性峰值可觀。其中對(duì)排名前10的2 245.8m/z和1 028.7m/z多肽峰進(jìn)行峰位點(diǎn)篩查，結(jié)合圖4，正常對(duì)照組峰值集中在300，非整倍體差異性極顯著的2 245.8m/z峰值集中在100，1 028.7m/z多肽峰集中在500，與對(duì)照組相比，重現(xiàn)性及差異性多肽顯著。最后，根據(jù)極顯著差異多肽峰2 245.8m/z和1 028.7m/z，對(duì)于正常對(duì)照組和非整倍體組進(jìn)行模型建立，發(fā)現(xiàn)Fisher、KNN、Linear SVM、RBF等模型中，RBF模型可區(qū)分正常對(duì)照組與非整倍體患者。

綜上所述，2 245.8m/z和1 025.7m/z多肽峰所建立的RBF理想模型，可作為區(qū)分正常對(duì)照組與非整倍體患者的理想模型。2 245.8m/z和1 028.7m/z多肽峰中所含的差異性多肽，可能是潛在的非整倍體患兒羊水多肽標(biāo)志物。但是，由于樣品量的限制，尚未鑒定出差異性多肽和它的功能。下一階段，將需要擴(kuò)大羊水樣本量，篩查差異性多肽。這對(duì)于探索非整倍體染色體異常疾病的發(fā)病機(jī)制，尋求臨床有效的防治手段有重要的指導(dǎo)意義。