江福能，朱瑩瑩，張玉婷，楊盛幫，吳永定，譚惠靜，鐘惟德

(1.華南理工大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院(廣州市第一人民醫(yī)院)中心實驗室，廣東 廣州 510180； 2.廣州醫(yī)科大學南山學院南山班， 廣東 廣州 511436)

3-磷酸甘油脫氫酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1)是甘油代謝途徑中的關鍵限速酶[1]，可與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)一同參與代謝反應，將糖酵解的中間產(chǎn)物磷酸二羥丙酮和NADH催化反應生成3-磷酸甘油和NAD+，以作為三酸甘油酯合成的G-3-P骨架[2-3]，直接決定了葡萄糖分解代謝中甘油合成方向的物質(zhì)流分配量和甘油合成水平[4]。GPD1廣泛分布于組織中，包括大腦的各個區(qū)域和內(nèi)部組織，其中腸系膜脂肪、皮下脂肪和十二指腸脂肪含量最高[5]。

在近期的研究中驗證了GPD1在人乳腺癌部分亞型中的表達顯著下降， GPD1是一種優(yōu)秀的人類乳腺癌標志物，且GPD1的表達與乳腺癌的預后有明顯的相關性，將GPD1表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳腺癌細胞中，發(fā)現(xiàn)其增殖、遷移和侵襲能力明顯下降；實驗選擇了21種類型的人類癌癥，其中7種癌癥也表現(xiàn)出了與GPD1表達水平一定的相關性；且實驗進一步闡述了GPD1可能是miR-370的直接靶點[6]，miR-370的調(diào)控已在各種癌癥中被報道[7-9]。

大量表達純化GPD1酶，可為進一步的機制研究和未來可能的腫瘤治療方向的研究與應用奠定基礎。本研究提取人細胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用特異引物通過PCR擴增GPD1基因，構建表達質(zhì)粒pPICZα-C-gpd1，將其電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33中，并通過甲醇誘導表達、鎳柱分離純化，建立了GPD1酶的基因工程制備方法。

1 材料和儀器

1.1 材料

菌株和質(zhì)粒載體：畢赤酵母X33和表達載體pPICZα-C(由廣東省農(nóng)業(yè)科學院王曉虎副研究員饋贈)，大腸桿菌DH5α(購自北京全式金生物技術有限公司)。PCR相關試劑(購自北京全式金生物技術有限公司)；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XbaⅠ、NheⅠ和SalⅠ(購自NEB(北京)有限公司)；質(zhì)粒小量提取試劑盒(購自廣州欣研生物科技有限公司)；酵母基因組提取試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)；DNA分子量marker(購自Takara公司)；ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit(購自南京諾唯贊生物科技有限公司)；酵母粉、胰蛋白胨(購自OXOID公司)，Zeocin、His標簽蛋白瓊脂糖純化樹脂(購自上海翊圣生物科技有限公司)；蛋白質(zhì)分子量marker[購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；酵母蛋白提取試劑盒[購自生工生物工程(上海)股份有限公司]；考馬斯亮藍快速染色液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型，購自上海碧云天生物技術有限公司)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

PCR儀(購自杭州朗基科學儀器有限公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)、電泳儀(購自上海天能科技有限公司)，微量分光光度計(購自杭州奧盛儀器有限公司)，點轉(zhuǎn)儀(購自Eppendorf公司)，全波長酶標儀(購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，臺式高速冷凍離心機(購自長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

2 方法

2.1 GPD1基因的PCR擴增

提取人細胞的總RNA并且逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA，以此為模板，采用一對GPD1基因的特異引物：GPD1-F(5′-GGCTGAAGCATCGATGAATTCTGCTAGC AAGAAAGTCTGCATTG-3′)和GPD1-R(5′-GAG ATGAGTTTTTGTTCTAGCATATGTTCTGGATGATTC TGCAGG-3′)，對GPD1基因進行PCR擴增，PCR程序為：95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收純化PCR產(chǎn)物中的目的條帶。

2.2 表達質(zhì)粒pPICZα-C-gpd1的構建

將pPICZαC載體用EcoRⅠ 和XbaⅠ雙酶切，經(jīng)切膠回收，利用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit將回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pPICZαC載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α 中，用含25 μg/mL Zeocin的LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)約16 h，挑取單菌落擴大培養(yǎng)，用質(zhì)粒小提試劑盒提取pPICZα-C-gpd1質(zhì)粒，用NheⅠ和SalⅠ雙酶切驗證，并且進行測序檢測。

2.3 電擊轉(zhuǎn)化pPICZα-C-gpd1及陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定

pPICZα-C-gpd1質(zhì)粒用Sac I線性化處理，使用電轉(zhuǎn)儀將線性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞中，電轉(zhuǎn)參數(shù)為電壓1 200 V，時間5 ms。加入600 μL預冷的1 mol/L的山梨醇，30 ℃靜置1～2 h后，涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPDS培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d。

選取長勢較好的單菌落，提取其基因組DNA作為模板，用α-factor-SF：5′-GCATCCTCCGCATTAGCTG-3′和GPD1-SR：5′-GTTCCCGGAGCCTACAATG-3′進行PCR擴增，PCR程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

2.4 甲醇誘導畢赤酵母表達GPD1

選取陽性畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，接種到5 mL YPD培養(yǎng)基中，28～30 ℃培養(yǎng)過夜，全部轉(zhuǎn)入100 mL BMGY培養(yǎng)基中，加入抗生素Zeocin至濃度為2 μL/mL，250 r/min，30 ℃振蕩培養(yǎng)16～18 h至A600nm=2.0～6.0。將培養(yǎng)液分裝至50 mL離心管中，4 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清，收集菌體，用滅菌水清洗2次，BMMY培養(yǎng)液清洗1次，加入20～30 mL的BMMY培養(yǎng)液重懸菌體沉淀，將菌液倒入具有400 mL培養(yǎng)基的2 L錐形瓶中，每瓶加入2 mL甲醇，于30 ℃，250 r/min培養(yǎng)誘導蛋白表達，每24 h向瓶中加入4 mL甲醇，誘導96 h；培養(yǎng)液經(jīng)8 000 r/min離心10 min，用酵母蛋白提取試劑盒提取菌體中的總蛋白，上清液和菌體總蛋白用15%的SDS-PAGE凝膠電泳，考馬斯亮藍染色，檢測GPD1酶的表達情況。

2.5 重組GPD1酶的純化

上清液用透析法將溶液換為PBS (pH7.4)。用0.22 μm濾膜過濾后，利用Profinia蛋白純化系統(tǒng)上樣于His標簽蛋白瓊脂糖純化樹脂，PBS洗滌去除雜蛋白，梯度咪唑洗脫目的蛋白，獲得純化的GPD1酶，用考馬斯亮藍染色檢測純化結(jié)果。

2.6 檢測純化蛋白的濃度

將BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)中的A液和B液按50∶1的體積比加到離心管中，混勻，得到工作液。把195 μL工作液加至96孔板中，每孔加入5 μL標準蛋白或者純化蛋白，混勻，37 ℃溫浴30 min。然后用酶標儀測定吸光度值(波長選擇562 nm)，利用標準曲線計算樣品的蛋白濃度。

3 結(jié)果

3.1 GPD1基因的PCR擴增結(jié)果

經(jīng)PCR擴增后，得到GPD1基因，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，最亮的條帶略大于1 000 bp，與理論大小(1 086 bp)相符(圖1)。

M. Marker； 1. PCR產(chǎn)物1； 2. PCR產(chǎn)物2； 3. PCR產(chǎn)物3。

3.2 重組表達質(zhì)粒pPICZα-C-gpd1的構建及鑒定結(jié)果

將切膠回收純化的PCR產(chǎn)物與表達載體pPICZα-C用EcoRⅠ和XbaⅠ進行雙酶切后用T4 DNA連接酶連接，得到重組表達載體pPICZα-C-gpd1(圖2)。為了確定重組載體是否構建成功，使用NheⅠ和SalⅠ對重組載體進行雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切產(chǎn)物大小與理論大小(1 086 bp和3 499 bp)相符(圖3)。DNA測序結(jié)果進一步證明重組載體pPICZα-C-gpd1構建成功，且未發(fā)生堿基突變。

(a) (b)

bpM1275050050003000200015001000250100

3.3 酵母陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定結(jié)果

用電擊轉(zhuǎn)化法，把經(jīng)SacI線性化的pPICZα-C-gpd1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞中，在含有Zeocin的YPDS培養(yǎng)基上培養(yǎng)至長出單菌落；分別提取長勢好的酵母轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，并以此為模板，用引物α-factor-SF和GPD1-SR進行PCR擴增，得到一條比250 bp略大的特異性條帶(圖4)。結(jié)果符合理論值(276 bp)，證實pPICZα-C-gpd1已成功整合入酵母基因組中。

bpM12345678920001000750500250100

3.4 GPD1的表達和純化

誘導后的上清液、誘導后的酵母總蛋白和純化后的重組GPD1酶分別經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，用考馬斯亮藍染色檢測，由檢測結(jié)果(圖5)可見上清液中的重組GPD1酶(37 500)比菌體中的多，表明重組GPD1酶主要被分泌到菌體外。使用Image-Pro Plus軟件分析圖5中條帶的灰度值，純化后的重組GPD1酶的純度為90.83%。

M. Marker； 1.未純化的培養(yǎng)液上清； 2.酵母總蛋白； 3.純化后的培養(yǎng)液上清。

3.5 GPD1重組酶的產(chǎn)量

利用BCA法測得純化蛋白的濃度為166.18 μg/mL，則純化后的重組GPD1酶的濃度為150.94 μg/mL，總共純化得到1.51 mg重組GPD1酶,重組GPD1酶的收率為3.55 mg/L。

4 討論

畢赤酵母表達系統(tǒng)是一種高效表達異源蛋白的真核表達系統(tǒng)，具有許多優(yōu)點，例如：操作簡易、易于培養(yǎng)、生長速度快、表達量高、不易形成包涵體、酵母表達載體含分泌型信號肽利于胞外表達、高密度發(fā)酵生產(chǎn)成本低,并且與大腸桿菌相比，不會引入內(nèi)毒素，該系統(tǒng)的安全性已得到美國 FDA 認可[10-12]。

pPICZα-C是一種常用的畢赤酵母蛋白表達載體，其含有Zeocin抗性基因，可以篩選獲得拷貝數(shù)高的轉(zhuǎn)化子，具有AOX1啟動子，能夠利用甲醇誘導高水平表達目的蛋白，該載體本身含有α-因子分泌信號肽，可以將目的蛋白分泌到胞外， 方便了后續(xù)的分離純化[13]。通過載體上的3個信號切除位點，該信號肽被自動切除。載體自身帶有 C-Myc和C-His 標簽，便于目的蛋白的檢測和純化。

本研究構建了畢赤酵母表達質(zhì)粒pPICZα-C-gpd1，成功篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，利用甲醇誘導和鎳柱純化獲得了分泌表達的GPD1酶，純度為 90% 以上，建立了畢赤酵母分泌表達GPD1酶的方法，為后續(xù)的GPD1腫瘤機制研究和靶向GPD1的抗腫瘤應用治療奠定了基礎。