曹斯瓊，程學(xué)仁，孫冬梅，索彩仙，周湘媛，邱韻靜，李國衛(wèi)

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244)

墨旱蓮別稱旱蓮草、金陵草、白花蟛蜞菊等，以原名鱧腸始載于《唐本草》[1]，為菊科植物鱧腸EcliptaprostrataL.的干燥地上部分，野生為主，生于河邊、田邊或路旁，主產(chǎn)河南、安徽、廣東、廣西、江蘇、山東等省區(qū)[2]。墨旱蓮是常用中藥之一，具有滋補(bǔ)肝腎、涼血止血的功效，用于肝腎陰虛、牙齒松動(dòng)、須發(fā)早白[3]。近代藥理學(xué)研究表明，墨旱蓮有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗感染、抗骨質(zhì)疏松、抗菌、調(diào)血脂[4-8]等活性作用。

墨旱蓮含有三萜皂苷類、噻吩類、香豆素、黃酮類、生物堿等成分[9-12]。目前，2015年版《中國藥典》墨旱蓮藥材項(xiàng)下僅對(duì)蟛蜞菊內(nèi)酯單一化學(xué)成分進(jìn)行含量測定，然而傳統(tǒng)中藥的療效是多成分共同作用的結(jié)果，單一活性成分并不能準(zhǔn)確反映藥材整體的質(zhì)量。本文采用超高效液相色譜法(UPLC)建立墨旱蓮藥材的指紋圖譜，結(jié)合指紋圖譜的相似度計(jì)算及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法，評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地的墨旱蓮藥材質(zhì)量，為墨旱蓮藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters H-Class超高效液相色譜儀(沃特斯公司)；Agilent ZORBAX SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)色譜柱；ME204E萬分之一天平、XP26百萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

咖啡酸對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.7%，批號(hào)：110885-201703)、木犀草苷對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：94.9%，批號(hào)：111720-201609)、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：94.1%，批號(hào)：111894-201102)、蟛蜞菊內(nèi)酯對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.6%，批號(hào)：111885-201403)均由中國食品藥品檢定研究院提供；3,4-二咖啡?？鼘幩?質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.0%，批號(hào)：wkq17060705)由四川維克奇生物科技有限公司提供；甲醇、乙醇為分析純；乙腈、三乙胺、磷酸為色譜純，水為超純水。

18批墨旱蓮藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為菊科植物鱧腸EcliptaprostrataL.的干燥地上部分，來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，磷酸緩沖液(含0.53%磷酸和0.8%三乙胺)為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～3 min，11%～16%A；3～9 min，16%A；9～20 min，16%～20%A；20～34 min，20%A；34～40 min，20%～80%A)；流速：0.30 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：330 nm；進(jìn)樣量：1 μL。

表1 墨旱蓮藥材來源Table 1 sample source information of Eclipta Herba

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蟛蜞菊內(nèi)酯、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、咖啡酸、木犀草苷和3,4-二咖啡酰奎寧酸對(duì)照品適量，加甲醇制得質(zhì)量濃度分別為7.705、4.033、8.467、7.550、9.267 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取墨旱蓮藥材粉末(過三號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 UPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液(M1)，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以蟛蜞菊內(nèi)酯峰為參比峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(M1)，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，以蟛蜞菊內(nèi)酯為參比峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品粉末(M1，過三號(hào)篩)6份，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以蟛蜞菊內(nèi)酯峰為參比峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD值均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立與相似度評(píng)價(jià)

取18批墨旱蓮藥材樣品，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。將18批藥材指紋圖譜cdf格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”，將M1號(hào)樣品的指紋圖譜作為參照?qǐng)D譜，并進(jìn)行全峰匹配，18批墨旱蓮藥材指紋圖譜疊加圖標(biāo)定共有峰8個(gè)，以平均數(shù)法生成墨旱蓮藥材對(duì)照?qǐng)D譜，結(jié)果見圖1、圖2。各批樣品的共有峰的“峰面積/稱樣量”見表3，各共有峰較穩(wěn)定，具有指紋圖譜特征性，可初步定為墨旱蓮藥材的指標(biāo)成分群。經(jīng)與對(duì)照品對(duì)照，確認(rèn)1號(hào)峰為咖啡酸峰，2號(hào)峰為木犀草苷峰，5號(hào)峰為4,5-二-O-咖啡?？鼘幩岱澹?號(hào)峰為蟛蜞菊內(nèi)酯峰。因蟛蜞菊內(nèi)酯峰分離效果好、出峰穩(wěn)定，選定為參照峰。對(duì)18批墨旱蓮藥材進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，18批樣品除M8外，均在0.90以上，說明各批次間相似度良好，結(jié)果見表3。

360340320300280260240220200180160140120100806040200M18M17M16M15M14M13M12M11M10M9M8M7M6M5M4M3M2M10246810121416182022242628303234363840t/minU/mV

2.6 墨旱蓮指紋圖譜的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.6.1 聚類分析 采用SPSS20.0軟件，以墨旱蓮藥材的8個(gè)共有峰的“峰面積/稱樣量”為變量，采用組間聯(lián)接方法對(duì)18批墨旱蓮藥材進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3?？梢?，當(dāng)判別條件距離為5時(shí)，18批墨旱蓮藥材被大致分為3類，M8藥材成一類，M2、M3、M6、M9、M10、M11、M13、M16成一類，其余的為一類，這與指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)的結(jié)果一致。

U/mV5040302010020181614121086420U/mV01020304010152025303505t/minAB

2.6.2 主成分分析 以藥材的8個(gè)共有峰峰面積為變量進(jìn)行主成分分析，以主成分特征值大于1為提取原則，根據(jù)表4的結(jié)果提取了2個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到84.952%，基本能代表原樣本的信息。成分載荷矩陣的數(shù)值及符號(hào)代表變量在主成分當(dāng)中的載荷，載荷越大，表明該化合物在藥材主成分分析中作用越大。由表5可見，峰1、峰3、峰5對(duì)成分1的影響大，對(duì)應(yīng)的成分為咖啡酸、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸和4,5-二-O-咖啡?？鼘幩幔环?、峰7、峰8對(duì)成分2的影響大，峰8為蟛蜞菊內(nèi)酯，為2015年版《中國藥典》含量測定指標(biāo)。以上結(jié)果說明，影響墨旱蓮藥材質(zhì)量的主要因素為酚酸類成分。酚酸類成分具有抗氧化、抗病毒、抗菌消炎、調(diào)節(jié)血脂及保肝等多種生物活性[13-14]，這與墨旱蓮的現(xiàn)代藥理作用相關(guān)。

以表6中的主成分1、主成分2的得分分別為橫、縱坐標(biāo)，生成18個(gè)樣品主成分得分圖，可以看出：M8藥材成一類，M2、M3、M6、M9、M10、M11、M13、M16成一類，其余的為一類，與聚類分析及特征圖譜相似度分析的結(jié)果均一致，結(jié)果見圖4。

表2 18批墨旱蓮藥材指紋圖譜共有峰峰面積測定結(jié)果Table 2 Results of common peak areas of specific chromatogram of 18 batches Eclipta Herba

表3 18批墨旱蓮藥材墨旱蓮藥材指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

0510152025471812141511756161011291338M4M7M18M12M14M15M1M17M5M6M16M10M11M2M9M13M3M8Y

表4 特征值及方差分析Table 4 characteristic value and analysis of variance

表5 主成分載荷矩陣Table 5 Principal component load matrix

表6 主成分得分表Table 6 Component score table

2.0001.0000.000-1.000-2.000主成分24.0002.0000.000-2.000主成分1

3 討論

墨旱蓮中含有香豆草醚類、皂苷類成分，故選用0.53%磷酸和0.8%三乙胺緩沖液為流動(dòng)相，色譜峰峰形最優(yōu)，基線平穩(wěn)。供試品溶液的制備分別考察了甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇、稀乙醇的提取效果，結(jié)果70%乙醇的提取效果最優(yōu)，能最大限度地提取墨旱蓮藥材的有效成分；通過對(duì)比回流和超聲2種提取方式，發(fā)現(xiàn)提取方式對(duì)墨旱蓮藥材的提取率影響較大，回流提取明顯優(yōu)于超聲提取，故選擇回流提取；同時(shí)還考察了不同提取時(shí)間(30、60、90 min)，結(jié)果表明加熱回流60 min的提取效果較好。

本研究對(duì)18批墨旱蓮藥材進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示18批樣品除M8外，相似度均在0.90以上，說明各批次間相似度良好；并對(duì)共有峰峰面積進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示18批墨旱蓮藥材被大致分為3類，M8藥材成一類，M2、M3、M6、M9、M10、M11、M13、M16成一類，其余的為一類，這與相似度評(píng)價(jià)的結(jié)果一致。利用主成分分析法，將8個(gè)共有峰變量降維為2個(gè)主成分變量，2個(gè)主成分能代表8個(gè)共有峰84.95%的信息，可將18批藥材分為3類，與相似度和聚類分析的結(jié)果一致。

結(jié)合表6 綜合得分分析結(jié)果，3種分析方法是基于藥材質(zhì)量把不同產(chǎn)地的墨旱蓮藥材分為3類：第1類為綜合評(píng)分排名10～18的9批樣品，分別為江蘇3批，山東、安徽各2批，廣西、廣東各1批，該類樣品質(zhì)量較差，含量偏低；第2類為綜合評(píng)分排名2～9的8批樣品，分別為江蘇3批，廣東2批，安徽、河南、山東各1批，該類樣品質(zhì)量較優(yōu)，含量較高，為《中國藥典》規(guī)定值的2～5倍；第3類為綜合評(píng)分排名第1的河南1批樣品(M8)，該樣品特征峰響應(yīng)較其他批次樣品高，其中影響主成分1的3個(gè)主要色譜峰為峰1、峰3、峰5，峰面積為其他批次的2.5倍以上，含量亦達(dá)到《中國藥典》規(guī)定值的3.8倍，質(zhì)量最好。綜上，本研究中河南產(chǎn)地的墨旱蓮藥材排名均在前十，質(zhì)量最優(yōu)；廣東產(chǎn)地的大部分藥材排名靠前，質(zhì)量次之；廣西產(chǎn)地的藥材排名靠后，質(zhì)量較差；江蘇、山東、安徽的藥材質(zhì)量呈現(xiàn)兩頭分布，說明這3個(gè)產(chǎn)地的藥材質(zhì)量不穩(wěn)定。

本研究所建立的墨旱蓮藥材UPLC指紋圖譜分析方法方便快捷、專屬性強(qiáng)，可為墨旱蓮藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)的方法，并為優(yōu)選墨旱蓮藥材產(chǎn)地提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。