臧彬如，周改蓮，單國(guó)順，賈天柱，孟莉

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，南寧 530001；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，大連 116600；3.遼寧省中醫(yī)藥研究院，沈陽(yáng) 110034)

鹿茸為鹿科動(dòng)物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，前者習(xí)稱花鹿茸，后者習(xí)稱馬鹿茸，其味甘、咸，性溫，歸腎、肝經(jīng)，功效壯腎陽(yáng)、益精血、強(qiáng)筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒，多用于治療腎陽(yáng)不足、精血虧虛、陽(yáng)痿滑精、宮冷不孕、羸瘦、神疲、眩暈、耳鳴等證[1-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，氨基酸類成分是鹿茸有機(jī)成分中含量最高的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[5]，具有良好的營(yíng)養(yǎng)支持和降血糖作用[6]。當(dāng)機(jī)體攝入鹿茸后，其中的蛋白質(zhì)和肽類物質(zhì)便可分解成小分子肽類和氨基酸以供機(jī)體吸收，從而使氨基酸發(fā)揮生物學(xué)活性[7]。梅花鹿茸中氨基酸類成分含量測(cè)定方法已有薄層掃描法[3]、高效液相色譜法[8]、氨基酸自動(dòng)分析[9]等，但由于薄層掃描法用于定量的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和精密度較差，氨基酸自動(dòng)分析法不能檢測(cè)脯氨酸且所用儀器復(fù)雜，價(jià)格較昂貴。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)前期通過(guò)液相色譜測(cè)定，分離效果差，抗干擾能力弱，準(zhǔn)確性不高[10]，且測(cè)定鹿茸中16種氨基酸類成分所用時(shí)間較長(zhǎng)，多成分含量同時(shí)測(cè)定色譜條件摸索較困難復(fù)雜[11]，因此筆者在本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法(ultra performance liquid chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-QqQ-MS/MS)技術(shù)建立梅花鹿茸中游離氨基酸的含量測(cè)定方法，與傳統(tǒng)氨基酸測(cè)定方法比較，該方法不僅準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好，且專屬性強(qiáng)，在固有設(shè)備特點(diǎn)中相較其他檢測(cè)設(shè)備具有分析性能強(qiáng)、分析速度快、靈敏度高等特點(diǎn)[12]，可用于梅花鹿茸的質(zhì)量控制，為該藥材資源的綜合利用與開發(fā)提供參考依據(jù)[13]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 ACQUITYTMUPLC I-Class系統(tǒng)，XEVO TQD型四極桿質(zhì)譜儀和MassLynx 4.0質(zhì)譜工作站軟件(美國(guó)Waters公司)，UV-T6型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，F(xiàn)A1004B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，感量：0.01 mg)；METTLER AE240型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司，感量：0.01 mg)，RO-2640P超純水器。

1.2試藥 蛋氨酸(批號(hào)：DST180402-098)、脯氨酸(批號(hào)：DST170724-039)、谷氨酸(批號(hào)：DST180402-078)、組氨酸(批號(hào)：DST180719-069)、酪氨酸(批號(hào)：DST171013-261)、天冬氨酸(批號(hào)：DST180619-897)、賴氨酸(批號(hào)：DST170918-108)、異亮氨酸(批號(hào)：DST180619-899)、蘇氨酸(批號(hào)：DST180723-135)、精氨酸(批號(hào)：DST180519-079)、苯丙氨酸(批號(hào)：DST180623-898)、纈氨酸(批號(hào)：DST070505-061)、色氨酸(批號(hào)：DST180603-134)、絲氨酸(批號(hào)：DST180526-190)、亮氨酸(批號(hào)：DST180613-124)、谷氨酰胺(批號(hào)：DST180712-896)對(duì)照品均購(gòu)于成都德思特生物技術(shù)有限公司，上述對(duì)照品經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均>98%。茚三酮(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：D1111A)。市售梅花鹿茸樣品信息見(jiàn)表1，所有樣品均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為真品，均為鹿科動(dòng)物梅花鹿Cervusnippon的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。水為超純水，由RO-2640P超純水器制備，乙腈、甲酸均為色譜純(德國(guó)Merck公司)，其余試劑均為分析純。

表1 市售梅花鹿茸樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1總游離氨基酸的含量測(cè)定

2.1.1對(duì)照品溶液的制備 精密量取干燥至恒重的色氨酸對(duì)照品約12.5 mg，置25 mL量瓶，加超純水稀釋并定容至刻度，得0.505 g·L-1對(duì)照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備 取梅花鹿茸樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩，篩孔內(nèi)徑297 μm，下同)約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶，加70%乙醇10 mL，超聲提取60 min，放冷，濾過(guò)，濾液加70%乙醇定容于25 mL量瓶，混勻，經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.1.3線性關(guān)系考察 分別精密量取色氨酸對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置25 mL量瓶，分別用水補(bǔ)足1.0 mL，依次加入乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 值5.0)0.5 mL和3%茚三酮乙醇溶液0.5 mL，沸水浴加熱20 min，取出，冷卻至室溫，加50%異丙醇溶液定容至刻度，搖勻，570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)。以色氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=1.305X-0.023 1(r=0.999 6)，線性范圍0.050 5～0.505 g·L-1。

2.1.4精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液(西豐縣遼北種鹿場(chǎng))約1.0 g，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，于570 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定A值6次，計(jì)算得RSD為0.2%，表明儀器精密度良好。

2.1.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液(西豐縣遼北種鹿場(chǎng))約1.0 g，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，0.5，1.0，1.5，2 h后，按“2.1.3”項(xiàng)方法操作，于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A，計(jì)算得RSD為1.9%，表明供試品溶液在顯色后2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液(西豐縣遼北種鹿場(chǎng))約1.0 g，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)方法操作，于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A，計(jì)算得RSD 為3.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液(西豐縣遼北種鹿場(chǎng))約0.5 g，共6份，精密稱定，分別加入色氨酸對(duì)照品溶液適量，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)方法操作，于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A，計(jì)算得平均加樣回收率為98.9%，RSD為2.1%，表明該方法回收率良好。

2.2游離氨基酸的含量測(cè)定

2.2.1色譜條件 ACQUITY BEH Amide色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，以20 mmol·L-1乙酸銨水溶液-含0.5%甲酸的乙腈溶液(15：85)為流動(dòng)相A，含0.5%甲酸的20 mmol·L-1乙酸銨水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～0.5 min，100%A；0.5～2.5 min，100%→96%A；2.5～3.5 min，96%→80%A，3.5～4 min，80%→62%A；4～6 min，62%→55%A；6～6.5 min，55%→100%A)；柱溫35 ℃；流速：0.6 mL·min-1；進(jìn)樣量1.5 μL。

2.2.2質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源(electrospray ion source，ESI)，負(fù)離子模式采集，數(shù)據(jù)采集范圍m/z50～1000，毛細(xì)管電離電壓2.0 kV，脫溶劑氣溫度300 ℃，脫溶劑氣流量600 L·h-1，錐孔氣流量50 L·h-1，噴霧氣氮?dú)?N2)，采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multimedia reaction monitoring mode，MRM)，詳細(xì)質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

2.2.3對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取對(duì)照品溶液適量，以超純水溶解并定容于25 mL量瓶，搖勻，制成含絲氨酸0.053 mg·mL-1、脯氨酸0.051 mg·mL-1、纈氨酸0.058 mg·mL-1、蘇氨酸0.044 mg·mL-1、亮氨酸0.061 mg·mL-1、天冬氨酸0.059 mg·mL-1、谷氨酸0.048 mg·mL-1、賴氨酸0.05 mg·mL-1、組氨酸0.049 mg·mL-1、苯丙氨酸0.068 mg·mL-1、精氨酸0.046 mg·mL-1、酪氨酸0.055 mg·mL-1、色氨酸0.045 mg·mL-1、谷氨酰胺0.062 mg·mL-1、異亮氨酸0.047 mg·mL-1、蛋氨酸0.063 mg·mL-1、次黃嘌呤0.066 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，密封避光保存。

2.2.4供試品溶液的制備 取梅花鹿茸樣品粉末適量(過(guò)三號(hào)篩，篩孔內(nèi)徑297 μm)，精密稱取約1.0 g，置具塞錐形瓶，精密加入超純水20 mL，超聲提取10 min，9500 r·min-1離心10 min(r=13.5 cm)后取上清液，殘?jiān)映兯?0 mL繼續(xù)超聲提取，如此反復(fù)3次，合并上清液，加超純水定容于100 mL量瓶，混勻，經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.5線性關(guān)系考察 分別精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用超純水稀釋制得系列對(duì)照品溶液。按“2.2.1”及“2.2.2”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，以各對(duì)照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。按信噪比(S/N)=3計(jì)算檢測(cè)限(limit of detection，LOD)，S/N=10計(jì)算定量限(limit of quantitation，LOQ)。結(jié)果表明各對(duì)照品質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，見(jiàn)表3和圖1。

表3 梅花鹿茸中16種游離氨基酸的線性范圍考察

1.組氨酸；2.精氨酸；3.絲氨酸；4.賴氨酸；5.谷氨酰胺；6.天冬氨酸；7.蘇氨酸；8.谷氨酸；9.脯氨酸；10.酪氨酸；11.纈氨酸；12.蛋氨酸；13.異亮氨酸；14.亮氨酸；15.苯丙氨酸；16.色氨酸。

Fig.1UPLC-MS/MSspectrumofmixedreferencesolution

2.2.6精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一濃度混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”和“2.2.2”項(xiàng)條件連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算得16種氨基酸峰面積RSD為1.4%～4.2%，表明儀器精密度良好。

2.2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液(西豐縣遼北種鹿場(chǎng))約1.0 g，按“2.2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別在制備后0，2，4，8，12，24 h按“2.2.1”和“2.2.2”項(xiàng)條件測(cè)定，結(jié)果16種氨基酸峰面積RSD為2.5%～4.9%，表明該方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液(西豐縣遼北種鹿場(chǎng))約1.0 g，按“2.2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2.1”和“2.2.2”項(xiàng)條件測(cè)定，結(jié)果16種氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為1.8%～4.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取已知各氨基酸含量的梅花鹿茸樣品(西豐縣遼北種鹿場(chǎng))約1.0 g，共9份，分別精密加入低(80%)、中(100%)、高(120%)3個(gè)水平對(duì)照品適量，每個(gè)水平3份，按“2.2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2.1”和“2.2.2”項(xiàng)條件測(cè)定，結(jié)果16種氨基酸平均加樣回收率97.7%～99.8%，RSD為1.2%～2.6%。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.3樣品測(cè)定 精密稱取15個(gè)廠家市售梅花鹿茸樣品，按“2.2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)方法及儀器條件測(cè)定總氨基酸和16種游離氨基酸的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5和圖2～4。

3 討論

目前報(bào)道的梅花鹿鹿茸質(zhì)量控制方法包括紫外分光光度法[14]、紅外光譜法[15]、薄層色譜法[3]、高效液相色譜法[8]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16]、氣相色譜法[17]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[18]及分子生物等多種技術(shù)。梅花鹿茸中常用于質(zhì)量控制的指標(biāo)有蛋白質(zhì)[19]、多糖[20]、氨基酸、多肽[21]等，其中氨基酸含量非常豐富[22]，且梅花鹿茸中的氨基酸可促進(jìn)人體蛋白質(zhì)合成，加快糖酵酶分解，提高人體造血能力。現(xiàn)代研究表明，有關(guān)梅花鹿茸的研究主要集中在氨基酸含量測(cè)定方面，但采用的方法多為紫外分光光度法和色譜法[23]，不能較直觀地反映梅花鹿茸中氨基酸含量變化情況。UPLC-MS作為一種新的分析技術(shù)，其質(zhì)譜采用特定離子對(duì)掃描模式，樣品中雜質(zhì)不會(huì)對(duì)待測(cè)成分產(chǎn)生干擾，且克服了UPLC分離度差的問(wèn)題，檢測(cè)信號(hào)高[24]，在短時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到有效分離[25]，擁有更低的定量下限[26]，從而被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分析，更適合應(yīng)用于梅花鹿茸藥材質(zhì)量控制和綜合評(píng)價(jià)[27]。

表4 梅花鹿茸中16種游離氨基酸的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表4 梅花鹿茸中16種游離氨基酸的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 市售梅花鹿茸樣品中總游離氨基酸及16種游離氨基酸的含量

圖2 主成分分析

圖3 偏最小二乘-判別分析

因此，筆者在本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-QqQ-MS/MS技術(shù)建立梅花鹿茸中游離氨基酸的含量測(cè)定方法，結(jié)果顯示該方法不僅操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、分析效率高，且還可以明確各種氨基酸的含量情況，更有利于對(duì)梅花鹿茸的質(zhì)量進(jìn)行控制[28]。

3.1離子模式的選擇 氨基酸作為兩性化合物，其結(jié)構(gòu)中同時(shí)包含氨基及羧基。理論上，ESI源下的含氮化合物本身在正離子模式下容易離子化，而羧基結(jié)構(gòu)則更容易在負(fù)離子模式下進(jìn)行離子化。本研究中為了得到更高的離子化強(qiáng)度，分別考察了不同氨基酸在正負(fù)離子模式下的響應(yīng)強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹿茸中的16種氨基酸在負(fù)離子模式下的響應(yīng)強(qiáng)度均強(qiáng)于正離子模式。

圖4 VIP得分圖

3.2色譜柱的選擇 由于氨基酸類化合物極性均較強(qiáng)，在反相C18色譜柱上多為弱保留，因而都很快隨流動(dòng)相流出，無(wú)法得到良好的分離。因此，為更好地對(duì)氨基酸類成分進(jìn)行分離和分析，筆者采用反相Amide雜化硅膠鍵合相色譜柱，實(shí)現(xiàn)了對(duì)氨基酸類成分的良好分離。

3.3流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)前期研究中先后嘗試使用不同比例的甲酸水和甲酸乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，但由于色譜峰的拖尾現(xiàn)象較為嚴(yán)重，考慮到目標(biāo)化合物的極性特征。因此，在流動(dòng)相中嘗試加入乙酸銨來(lái)改善色譜峰的峰形，結(jié)果取得滿意的效果。

3.4提取方式的選擇 梅花鹿茸樣品提取方法，筆者先后采用回流法和冷浸法，但上述兩種方法對(duì)氨基酸類物質(zhì)的提取效率均較低，且回流法所用時(shí)間較長(zhǎng)，方法重復(fù)性較差。因此，筆者又嘗試了超聲提取法，結(jié)果方法的提取時(shí)間短，提取效率高，方法重現(xiàn)性好，適合作為梅花鹿茸樣品的提取方法。

筆者在本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-QqQ-MS/MS技術(shù)建立鹿茸中游離氨基酸的含量測(cè)定方法，并對(duì)15個(gè)廠家的市售梅花鹿茸樣品進(jìn)行含量測(cè)定[22]。結(jié)果顯示，不同廠家梅花鹿茸樣品中，氨基酸的組成和含量上均存在一定的差異。采用主成分分析(principal component analysis，PCA)，結(jié)果從PCA圖中可以看出梅花鹿茸樣品可分為兩類。其中，綠色部分為S2、S3、S4、S5、S6、S11和S12的梅花鹿茸樣品，紅色部分為S1、S7、S8、S9、S10、S13、S14和S15的梅花鹿茸樣品，結(jié)合數(shù)據(jù)分析可見(jiàn)，紅色部分為合格樣品，綠色部分為不合格樣品。進(jìn)一步采用偏最小二乘-判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)，合格樣品與不合格樣品得到很好的分類，結(jié)合VIP得分圖中所示VIP值(選擇VIP值>1的成分作為起主要作用的成分)的情況可知，總游離氨基酸對(duì)梅花鹿茸的品質(zhì)影響最大，同時(shí)，賴氨酸、異亮氨酸、絲氨酸和谷氨酸也對(duì)梅花鹿茸的品質(zhì)有一定的影響。這可能與不同產(chǎn)地梅花鹿茸的采收和加工方式有關(guān)。因此，有必要在以后的研究中對(duì)梅花鹿茸的炮制工藝做進(jìn)一步優(yōu)化，以保證梅花鹿茸飲片質(zhì)量的穩(wěn)定可靠。鑒于目前梅花鹿茸中的活性成分不明確，藥效機(jī)制不明晰，梅花鹿茸中活性成分的確定以及相關(guān)藥效機(jī)制的研究都值得進(jìn)一步研究。