余奕宏， 顧苑婷， 丁筑紅， 陳思奇， 宋煜婷， 王 翼

(貴州大學 釀酒與食品工程學院/國家林業(yè)和草原局刺梨工程技術研究中心/貴州省農畜產品貯藏加工重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

刺梨中天然黃酮類化合物大部分是以與糖結合的黃酮糖苷的形式存在，是植物的次生代謝產物[1]，研究證明，黃酮結合型糖苷藥物活性遠遠低于游離的苷元，通過去糖基定向修飾黃酮類化合物的分子結構可以發(fā)揮其特定功能[2]。生物轉化去糖基是最經濟綠色的途徑，目前利用最多的為β-葡萄糖苷酶[3]，但是不同來源的β-葡萄糖苷酶對底物水解的酶性能相差很大且安全性存疑[4-5]。因此，選擇合適來源的β-葡萄糖苷酶和提升其對黃酮類化合物的水解效果成為研究的重點。刺梨中黃酮類物質作為其重要的活性成分[6]，目前研究缺乏系統(tǒng)和深度，相關報道僅限于黃酮含量及檢測方法、提取技術及黃酮粗提物功能評價[7-8]等，對刺梨黃酮類化合物的生物轉化方面未見報道。

目前報道較多的常用于食品的β-葡萄糖苷酶主要來源于杏仁[9]、木霉(Trichoderma)[10]和乳酸菌(Lactobacillus)[11]。本項目組前期研究發(fā)現，嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus) GIM1.208β-葡萄糖苷酶釋放刺梨槲皮素(Que2)含量為處理前原料的5.42倍。因此本實驗通過分析木霉、杏仁及嗜酸乳桿菌3種來源的β-葡萄糖苷酶酶解刺梨槲皮素-3-O-蕓香糖苷(Rut)、槲皮素-3-O-鼠李糖苷(Que)和槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Iso)的黃酮苷元特性及酶解條件，篩選較優(yōu)β-葡萄糖苷酶，探討提高刺梨黃酮苷元釋放能力的生物轉化途徑，以期為刺梨黃酮的研究開發(fā)提供理論基礎，為藥物和功能食品提供豐富的資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨：貴農5號種植品種，摘于貴州省龍里縣，新鮮潔凈，大小均勻無霉爛，密封裝袋后凍藏于-20 ℃的冰箱備用。

試劑：槲皮素標準品、槲皮素-3-O-鼠李糖苷標準品、槲皮素-3-O-葡萄糖苷標準品、槲皮素-3-O-蕓香糖苷標準品，純度均大于等于98.0%，上海源葉生物科技有限公司；對硝基苯酚，南京大唐化工有限責任公司；對硝基苯酚-β-D葡萄糖苷(p-NPG)、杏仁β-葡萄糖苷酶，美國Sigma公司；嗜酸乳桿菌GIM.1.208，貴州輕化工中心；木霉β-葡萄糖苷酶(Trichodermaβ-glucosidase)，江蘇銳陽生物科技有限公司；無水乙醇、磷酸，均為分析純，濟南明星化工有限公司；甲醇、乙腈，均為色譜純，美國Tedia公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

1260型高效液相色譜儀(配有DAD檢測器/紫外-熒光檢測器)，美國Agilent公司；SpectraMAX190型光吸收酶標儀 ，美谷分子儀器(上海)有限公司；TGL20M型臺式高速冷凍離心機，諸城鼎力機械有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1液相色譜條件

參考文獻[12]，色譜柱為ACI C18(250 mm×4.6 mm)，流動相為乙腈-0.4%磷酸水溶液(體積比28∶72)，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長360 nm，進樣量10 μL。

1.3.2酶比活力的測定

酶比活力的測定采用丁小娟等[13]的方法，即以p-NPG為底物,在β-葡萄糖苷酶作用下水解成p-NP(對硝基苯酚)和葡萄糖,利用p-NP在堿性條件下顯色的原理，測定β-葡萄糖苷酶的酶活力。1 mL酶液1 min酶解1 μmolp-NPG產生1 μmolp-NP所需的酶量，定義為一個酶活力單位，以U/mL表示。

1.3.3菌種活化培養(yǎng)基配制

MRS培養(yǎng)基：參照丁小娟等[13]配制方法。

菌種活化：MRS活化培養(yǎng)液121 ℃，0.1 MPa滅菌30 min，接入嗜酸乳桿菌GIM.1.208，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h備用。

1.3.4標準溶液的配制

稱取槲皮素4.5 mg，槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷標準品各5.0 mg加甲醇溶解，于25 mL容量瓶中定容，得到質量濃度分別為0.18、0.20、0.20、0.20 mg/mL標準品儲備液，分別吸取0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mL定容至20 mL容量瓶中，進行HPLC分析。以HPLC測得的峰面積為y軸，標準品質量濃度為x軸，繪制標準曲線。

1.3.5樣品溶液的制備

將刺梨真空冷凍干燥后粉碎，得刺梨干粉備用。稱取適量刺梨粉于錐形瓶中按液料比20∶1 (mL/g)加入體積分數70%乙醇，300 W、50 ℃條件下超聲40 min，石油醚去除脂溶性色素，4 000 r/min 離心5～10 min，收集上清液濃縮，加入預處理好的HPD600樹脂層析柱上進行純化富集，吸附飽和后，用體積分數70%乙醇洗脫，收集洗脫液，制得純化樣品溶液，滅活內源酶備用。

1.3.6不同來源β-葡萄糖苷酶對槲皮素糖苷轉化率的測定

參照文獻[12]適當修改。以不加任何酶的體系為空白組，其他實驗組分別加入1 U/mL的3種β-葡萄糖苷酶[14]。反應體系200 μL，包含樣品液20 μL、磷酸鈉緩沖溶液(pH值5，50 mmol/L)120 μL、酶液60 μL。在50 ℃，pH值5的條件下分別反應10、20、30、40、50、60 min，反應完成后冰浴3 min終止反應，加入等體積甲醇，樣品經0.45 μm濾膜過濾，取10 μL進行HPLC檢測，根據式(1)，計算各β-葡萄糖苷酶酶解槲皮素糖苷的轉化率。

(1)

式(1)中：ρ為酶解前槲皮素糖苷質量濃度，μg/mL，ρ0為酶解后剩余糖苷質量濃度，μg/mL。

1.3.7杏仁β-葡萄糖苷酶水解槲皮素糖苷單因素實驗

反應體系200 μL：樣品液20 μL、磷酸鈉緩沖溶液(pH值5，50 mmol/L)120 μL、酶液60 μL。分別考察酶解時間(10、20、30、40、50、60 min)、酶解pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)、酶解溫度(30、35、40、45、50、55、60 ℃)、酶用量(酶與底物質量比)(0.030%、0.040%、0.050%、0.075%、0.100%、0.200%)對糖苷轉化率的影響，反應完成后冰浴3 min終止反應，加入等體積甲醇，樣品經0.45 μm濾膜過濾，取10 μL進行HPLC檢測[12,15]。

1.3.8響應面優(yōu)化試驗

在最優(yōu)來源的杏仁β-葡萄糖苷酶水解條件單因素實驗結果基礎上，進行 Box-Behnken 試驗，以槲皮素-3-O-蕓香糖苷轉化率(Y1)、槲皮素-3-O-鼠李糖苷轉化率(Y2)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷轉化率(Y3)為評價指標，進行四因素三水平Box-Behnken試驗，因素與水平見表1。

1.4 數據處理

每組實驗重復3次，采用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析，Design-Expert 8.0.6軟件設計響應面試驗方案，建立數學模型并進行多元回歸分析，

Origin 8.0軟件制圖。

表1 響應面試驗因素與水平

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

回歸方程與線性范圍見表2，考察結果證明3種糖苷在0.01～0.20 mg/mL線性良好，槲皮素在0.004 5～0.144 0 mg/mL線性良好，可為后續(xù)樣品含量測定提供可靠依據。

表2 不同黃酮化合物的回歸方程

2.2 不同來源β-葡萄糖苷酶對刺梨槲皮素糖苷的酶解效果

2.2.1β-葡萄糖苷酶對槲皮素糖苷轉化率的影響

圖1 不同來源β-葡萄糖苷酶對槲皮素糖苷轉化率的影響Fig.1 Effect of β-glucosidase from different sources on conversion rate of quercetin glycosides

β-葡萄糖苷酶通過斷裂槲皮素糖苷化合物之間的糖苷鍵來完成對底物的水解，不同來源的β-葡萄糖苷酶結構與組成不同，糖基化程度、糖鏈聚合度、糖鏈分支與相對分子質量差異較大，一級結構、活性區(qū)域氨基酸序列中心基團以及具催化作用的氨基酸殘基排列及狀態(tài)不同[16]，從而導致它們對不同底物親和力及水解機制存在差異。3種來源的β-葡萄糖苷酶對槲皮素糖苷轉化率的影響見圖1。由圖1可以看出，反應60 min時，3種β-葡萄糖苷酶對槲皮素-3-O-葡萄糖苷的轉化率均為最高，分別為74.10%、70.50%、62.50%。β-葡萄糖苷酶水解槲皮素糖苷鍵的能力取決于糖基[17]，槲皮素苷元的糖基不同對酶的水解效率影響顯著[18]，且雙糖苷的轉換速率比單糖苷慢。槲皮素-3-O-葡萄糖苷只有一個葡萄糖基，在葡萄糖基的特定位點處的羥基可以形成額外的氫鍵，增強酶與底物的作用[19]，因而β-葡萄糖苷酶對槲皮素-3-O-葡萄糖苷水解轉化率最高。

2.2.2β-葡萄糖苷酶對槲皮素含量的影響

圖2 不同來源β-葡萄糖苷酶對槲皮素含量的影響Fig.2 Effect of β-glucosidase from different sources on quercetin content

不同來源β-葡萄糖苷酶對槲皮素含量的影響見圖2。由于β-葡萄糖苷酶的種類眾多，其苷元結合位點處的氨基酸殘基呈現多樣性，活性位點外的部分氨基酸也能通過非共價作用影響活性中心的氨基酸對底物的專一性[20]。此外，β-葡萄糖苷酶催化活性中心結構以及氨基酸活性位點位置不同導致表面電勢差異，因此，β-葡萄糖苷酶與構成苷元結合位點的氨基酸殘基及與活性中心以外的氨基酸殘基的作用機制存在差異[21]，使不同β-葡萄糖苷酶具有不同的底物結合及催化作用模式。由圖2可以直觀地看出各來源的β-葡萄糖苷酶對槲皮素糖苷的整體轉化程度。由杏仁β-葡萄糖苷酶轉化所得槲皮素含量一直最高，反應30 min時含量達到152.60 μg/mL。水解作用較優(yōu)的杏仁β-葡萄糖苷酶對不同底物的轉化率由高到低依次為槲皮素-3-O-葡萄糖苷(74.10%)、槲皮素-3-O-蕓香糖苷(64.30%)、槲皮素-3-O-鼠李糖苷(31.80%)，因此，杏仁β-葡萄糖苷酶為較優(yōu)水解酶，槲皮素-3-O-葡萄糖苷為較佳酶解底物。

2.3 酶解條件對杏仁β-葡萄糖苷酶轉化槲皮素糖苷的影響

2.3.1酶解pH值的影響

pH值對酶解反應的影響見圖3。由圖3可知，隨著體系pH值增加，槲皮素糖苷轉化率上升顯著，在pH值5.0時達到最高；當體系pH值大于5.0時，糖苷轉化率快速下降。pH值是影響β-葡萄糖苷酶活性的重要因素，酶的兩端具有游離的氨基和羧基，對pH值極為敏感，反應體系過酸或過堿都會使酶的活性架構解離受到影響[26]，降低底物與酶的結合程度。因此，選擇pH值5.0為優(yōu)化的酶解pH值。

圖3 酶解pH值對槲皮素糖苷含量及轉化率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis pH on content and conversion rate of quercetin glycoside

2.3.2酶解溫度的影響

圖4 酶解溫度對槲皮素糖苷含量及轉化率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on content and conversion rate of quercetin glycoside

酶解溫度對酶解反應的影響見圖4。由圖4可知，隨酶解溫度的升高，糖苷轉化率先升高后下降。當溫度達到45 ℃時，槲皮素-3-O-葡萄糖苷轉化率達到最高；當溫度為50 ℃時，槲皮素-3-O-蕓香糖苷與槲皮素-3-O-鼠李糖苷轉化率最高，且此時槲皮素含量最大，所以溫度選擇50 ℃為宜。由于低溫影響分子運動的能量，在低溫時，酶活化分子少活性低，槲皮素糖苷分子與酶分子活性部位接觸較少導致反應速率慢。溫度的升高使得酶分子運動加速，酶解反應進行較快；但隨著溫度的增加，穩(wěn)定酶的共價鍵也逐漸被消除，酶部分展開變得松弛[22]，溫度過高導致維持酶分子結構的次級鍵解體[22]，蛋白質核心的疏水性殘基暴露在溶劑中，使得蛋白質聚集，造成酶不可逆地解構變性失活[23]，酶解反應被抑制。

2.3.3酶用量的影響

圖5 酶用量對槲皮素糖苷含量及轉化率的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on content and conversion rate of quercetin glycoside

酶用量對酶解反應的影響見圖5。由圖5可知，隨著酶用量的增加，糖苷轉化率隨之不斷升高；當酶用量達到0.075%后，增加酶用量，轉化率基本保持不變，選擇酶用量0.075%為宜。當酶用量較小時，糖苷底物充足，隨著酶用量的增加，酶與底物結合程度增強，酶促反應速度與底物濃度成正比[24]，轉化率呈現上升趨勢；當酶與底物質量比達到一定比例，糖苷底物分子結合點飽和，抑制酶解[22]，繼續(xù)增大酶用量不會使轉化率顯著提高。

2.4 響應面試驗分析

2.4.1響應面試驗結果

杏仁β-葡萄糖苷酶酶解條件響應面試驗設計與結果見表3，方差分析見表4至表6。

表3 響應面試驗設計與結果

表4 槲皮素-3-O-蕓香糖苷方差分析及顯著性結果

通過軟件對表3數據進行二次多項式回歸擬合，得到槲皮素糖苷轉化率回歸方程：

表5 槲皮素-3-O-鼠李糖苷方差分析及顯著性結果

表6 槲皮素-3-O-葡萄糖苷方差分析及顯著性結果

2.4.2響應面分析與驗證實驗

各因素交互作用對槲皮素糖苷轉化率的影響如圖6至圖8。從圖6(a)、圖6(b)可以看出，酶解時間和酶解溫度交互作用顯著，酶解溫度和酶用量交互作用極顯著，表現為等高線密集，響應面曲面陡峭。表明β-葡萄糖苷酶酶解槲皮素-3-O-蕓香糖苷時對溫度敏感，同時也受酶解時間、酶用量的影響。同理，從圖7(a)、圖7(b)可以看出，酶解時間和酶用量交互作用顯著，酶解pH值和酶用量交互極顯著，表明β-葡萄糖苷酶酶解槲皮素-3-O-鼠李糖苷時對酶用量較敏感，同時也受酶解時間、酶解pH值的影響。從圖8(a)、圖8(b)可以看出，酶解時間和酶用量交互作用極顯著，酶解溫度和酶用量交互顯著，表明β-葡萄糖苷酶酶解槲皮素-3-O-葡萄糖苷時對酶用量較敏感，同時也受酶解時間、酶解溫度的影響。

圖6 各因素交互作用對槲皮素-3-O-蕓香糖苷轉化率的影響Fig.6 Effect of interaction of various factors on quercetin-3-O-rutinoside conversion rate

根據響應面計算得到各因素優(yōu)化酶解條件為酶解時間28.91 min、酶解pH值4.9、酶解溫度51.55 ℃、酶用量0.08%，通過方程得到糖苷轉化率預測值為槲皮素-3-O-蕓香糖苷72.52%，槲皮素-3-O-鼠李糖苷37.10%，槲皮素-3-O-葡萄糖苷78.40%?？紤]實際操作修正實驗條件為酶解時間28.90 min、酶解pH值4.9、酶解溫度52 ℃、酶用量0.08%，此條件下對酶解工藝進行3次平行實驗，得到槲皮素-3-O-蕓香糖苷轉化率為71.48%，RSD=0.49%；槲皮素-3-O-鼠李糖苷轉化率36.32%，RSD=1.67%；槲皮素-3-O-葡萄糖苷轉化率77.86%，RSD=0.35%。槲皮素糖苷實際平均轉化率分別達到理論預測值的98.57%、97.90%、99.31%，實驗值與預測值吻合較好，模型擬合度達到98.4%，說明該模型可以用來優(yōu)化杏仁β-葡萄糖苷酶水解3種槲皮素糖苷實驗。

3 結 論

通過利用HPLC對糖苷轉化率及槲皮素含量進行動態(tài)監(jiān)測，根據3種糖苷轉化所得槲皮素含量對比得出杏仁β-葡萄糖苷酶為最優(yōu)水解酶，槲皮素-3-O-葡萄糖苷為最佳水解底物。

圖7 各因素交互作用對槲皮素-3-O-鼠李糖苷轉化率的影響Fig.7 Effect of interaction of various factors on quercetin-3-O-rhamnoside

圖8 各因素交互作用對槲皮素-3-O-葡萄糖苷化率的影響Fig.8 Effect of interaction of various factors on quercetin-3-O-glucoside conversion rate

利用Box-Behnken 中心組合方法對杏仁β-葡萄糖苷酶水解3種糖苷進行響應面試驗設計，確定了優(yōu)化酶解工藝：酶解時間28.90 min，酶解pH值4.9，酶解溫度52 ℃，酶用量0.08%，此條件下得到槲皮素-3-O-蕓香糖苷轉化率為71.48%，槲皮素-3-O-鼠李糖苷轉化率36.32%，槲皮素-3-O-葡萄糖苷轉化率77.86%。