陳 夢(mèng)， 付曉丹， 朱常亮， 牟海津，*， 韓振蓮

(1.中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266003;2.淮陰師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 淮安 223300)

κ-卡拉膠及其寡糖的抗凝血作用已被證實(shí)[1]，而有報(bào)道指出改善高血壓病人的凝血功能有助于控制患者的病情[2]，這說明 κ-卡拉膠可能具有潛在降壓作用。當(dāng)人體攝入的鉀離子增多，細(xì)胞膜上的“鈉鉀泵”會(huì)充分地將K+泵入細(xì)胞內(nèi)以形成高鉀環(huán)境，同時(shí)使Na+外流，并隨尿液排出，減輕了胞內(nèi)鈉離子過多導(dǎo)致機(jī)體大量飲水而出現(xiàn)的細(xì)胞外液、血容量增多以及心室充盈等現(xiàn)象，進(jìn)而減輕血壓升高現(xiàn)象。κ-卡拉膠的重復(fù)二糖單元攜帶一個(gè)負(fù)電荷，可以與溶液中的陽離子結(jié)合；分子卡拉膠經(jīng)酶解成短鏈糖結(jié)構(gòu)，其空間結(jié)構(gòu)得以舒展，硫酸根基團(tuán)也得以更大程度地暴露進(jìn)而與鉀離子更充分地接觸，提高鉀離子的結(jié)合率。

腸道菌群被視為人類的第二基因組，其對(duì)機(jī)體各方面的調(diào)控作用不容小覷?？ɡz一直都被證實(shí)有多種生理活性，并且有潛力成為功能性食品和藥物開發(fā)的益生元?jiǎng)Ｈ欢?，到目前為止仍舊沒有相關(guān)實(shí)驗(yàn)揭示卡拉膠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)腸道菌群的影響。眾多研究表明，腸道菌群失調(diào)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)多種慢性和急性病征，如高血壓[3]、糖尿病[4]、結(jié)腸炎[5]、過敏[6]等。有學(xué)者指出腸道菌群失衡往往發(fā)生在高血壓之前，而機(jī)體一旦患上高血壓又會(huì)反作用于腸道菌群[7]，腸道菌群失調(diào)與高血壓處于一種互相促進(jìn)的狀態(tài)，因此腸道菌群的調(diào)整和改善可以作為防治高血壓的一個(gè)切入點(diǎn)。

研究利用制備的低分子質(zhì)量的酶解卡拉膠鉀為實(shí)驗(yàn)材料，分析其對(duì)原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的降血壓功效和對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，重點(diǎn)關(guān)注腸道內(nèi)環(huán)境的改善、短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)的變化以及菌群組成上的差異等，以期從腸道環(huán)境及菌群的角度對(duì)低分子質(zhì)量卡拉膠鉀(LCP)降低SHR血壓的可能機(jī)理進(jìn)行更深一步的闡釋。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卡托普利，深圳海王藥業(yè)有限公司；低分子質(zhì)量卡拉膠鉀(分子質(zhì)量3.5 kDa)，本實(shí)驗(yàn)室制備； SCFAs標(biāo)準(zhǔn)品、異己酸純物質(zhì)原液，西格瑪貿(mào)易有限公司；脂多糖試劑盒，上海酶聯(lián)免疫公司；體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定液，中山康乃欣生物醫(yī)療有限公司；地衣酚，上海一研試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q Reference型超純水系統(tǒng)，美國默克密理博公司；XW-80A型旋渦混合器，海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；Olympus BX41型熒光顯微鏡，南京貝登醫(yī)療股份有限公司；1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司； KC-811型色譜柱，北京恩加壹科技有限公司。SPF級(jí)的雄性SHR 18只[9周齡，220～260 g，收縮壓大于165 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)]，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物飼養(yǎng)與血壓測定

18只SHR于SPF級(jí)屏障環(huán)境動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，溫度：22～26 ℃；濕度：50%～70%；飼養(yǎng)密度：3只/籠。SHR的頭、背、尾3個(gè)部位分別被染上苦味酸(黃色)作為區(qū)分標(biāo)記；人為控制光照環(huán)境，保持生存環(huán)境12 h光照，12 h黑暗。根據(jù)體重和血壓平均分為3組，每組6只，保證組間初始血壓平均值盡可能接近。根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]，實(shí)驗(yàn)劑量如下：空白對(duì)照(B)組灌胃蒸餾水，實(shí)驗(yàn)(LCP)組灌胃LCP[600 mg/(kg·d)]，陽性對(duì)照(P)組灌胃卡托普利[10 mg/(kg·d)]。實(shí)驗(yàn)持續(xù)6周，每周定時(shí)定點(diǎn)測量收縮壓(SBP)1次，完全按儀器的測量方法進(jìn)行操作，等大鼠在黑暗密閉環(huán)境完全安靜后儀器自動(dòng)讀數(shù)，每只大鼠測量5次，若有相差較大的數(shù)值，當(dāng)場剔除，保證5次測量結(jié)果相差不大。并稱重2次以便根據(jù)體重隨時(shí)微調(diào)實(shí)際灌胃體積。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，乙醚迷暈大鼠，腹主動(dòng)脈取血， 注意收集盲腸內(nèi)容物。

1.3.2短鏈脂肪酸的測定

樣品前處理(水提法)：取保存于-80 ℃冰箱的LCP組的盲腸內(nèi)容物置于冰盒上，冷凍狀態(tài)下用消毒的鑷子稱取0.3 g左右置于2 mL EP管中，用超純水定容至刻度線，混勻后冷凍離心。將上清液轉(zhuǎn)移至另外的離心管中，注入60 μL 2 mg/mL的磺基水楊酸以除去蛋白質(zhì)，充分混勻后冷凍離心。取1 mL上清液，加入異己酸原液12.5 μL以保證和標(biāo)準(zhǔn)品中異己酸的濃度一致，混合均勻，冷藏待用。

色譜條件：色譜柱為離子排阻KC-811色譜柱(8.0 mm×300 mm)；流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)0.01% H3PO4(pH值3.12)，柱溫50 ℃，流速0.8 mL/min，檢測器為紫外檢測器，波長210 nm，檢測時(shí)間35 min。

短鏈脂肪酸的測定采用內(nèi)標(biāo)法[9]，內(nèi)標(biāo)物為異己酸，計(jì)算見式(1)～式(3)。

(1)

式(1)中，Ar，標(biāo)準(zhǔn)品中異己酸的峰面積；As，待測樣品中異己酸的峰面積。

則待測樣品中相應(yīng)SCFAs的質(zhì)量濃度ρi為：

(2)

式(2)中，Ai，待測樣品中相應(yīng)SCFAs的峰面積；Ari，標(biāo)準(zhǔn)品中相應(yīng)SCFAs的峰面積；ρri，標(biāo)準(zhǔn)品中相應(yīng)SCFAs的質(zhì)量濃度，mg/L。

則盲腸內(nèi)容物中SCFAs的含量(mg/g)為：

(3)

式(3)中，2，樣品體積，mL；m，稱取的盲腸內(nèi)容物的質(zhì)量，g。

1.3.3菌群多樣性分析

針對(duì)16S rRNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行Miseq擴(kuò)增子測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、質(zhì)控、去接頭之后獲得優(yōu)化序列，基于優(yōu)化序列進(jìn)行OTU聚類，獲得OTU豐度表，用于后續(xù)生信分析。對(duì)于Beta多樣性分析，基于Bray_Curtis weighted和unweighted unifrac距離計(jì)算距離矩陣，使用PCoA進(jìn)行結(jié)果可視化展示；使用非參數(shù)的adonis分析(PerMANOVA)檢測組間差異是否顯著，以及分組因素對(duì)組間差異的解釋度。使用Welch’s t tests進(jìn)行不同組間門和屬水平物種豐度變化的差異分析，使用Bonferroni進(jìn)行多重檢驗(yàn)校準(zhǔn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)偏差，組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)的方法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LCP對(duì)SHR收縮壓的影響

SHR不同時(shí)間段的收縮壓見表1。由表1可知，空白組SHR的血壓值隨周齡增加而上升，第3周穩(wěn)定在210 mmHg左右。LCP組在灌胃第1周基本無降壓作用，從第2周開始便控制血壓不再上升，第3周開始與空白組有了顯著差異(P<0.05)，這種顯著的降壓效果持續(xù)到了第4周，第5周血壓略有回升，但在第6周與空白組血壓相比出現(xiàn)極顯著差異(P<0.01)，降壓效果明顯，總體上與空白組相比，有18 mmHg左右的血壓差，說明LCP具有一定的降壓作用且能夠保持穩(wěn)定持續(xù)的降壓效果。陽性對(duì)照組控制血壓的效果較為明顯，灌胃1周后就出現(xiàn)了顯著的降壓效果并持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，但是對(duì)照組在第3周血壓出現(xiàn)波動(dòng)。

表1 每組SHR不同時(shí)間段的收縮壓

2.2 各組間SCFAs的含量變化

SCFAs也稱揮發(fā)性脂肪酸，是碳鏈中碳原子數(shù)在1～6的有機(jī)脂肪酸，包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸等，其中乙酸、丙酸、丁酸的總含量在95%以上[10]。90%的SCFAs是由腸腔內(nèi)厭氧菌酵解食物中不消化的碳水化合物成分產(chǎn)生，余下與蛋白質(zhì)代謝和飲食組成相關(guān)。SCFAs被腸上皮細(xì)胞吸收后可為線粒體提供能量，尤其是丁酸，其含量占腸道SCFAs總含量的80%以上，是腸上皮細(xì)胞的主要供能者。丁酸可調(diào)節(jié)腸道內(nèi)部的酸堿性，降低pH值，減少有害菌的生長[11]；還可抑制炎癥因子的生成，降低免疫應(yīng)答效應(yīng)，控制結(jié)腸炎癥的發(fā)展等[12]。

*、** 分別表示與空白組相比有顯著、極顯著差異，#、##分別表示與對(duì)照組相比有顯著、極顯著差異。圖1 各組盲腸內(nèi)容物中乙酸、異丁酸及丁酸的含量比較Fig.1 Comparison of acetic acid, isobutyric acid and butyric acid contents in each group

盲腸內(nèi)容物SCFAs含量變化見圖1。在乙酸含量上，LCP組與空白組相比出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，且與對(duì)照組相比呈現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)，顯示出LCP在改善腸道內(nèi)環(huán)境方面明顯優(yōu)于卡托普利的特性。前人研究發(fā)現(xiàn)，異丁酸最主要作用是利于纖維分解菌的生長，在日糧中添加異丁酸等，白色瘤胃球菌成為優(yōu)勢菌群[13]。本實(shí)驗(yàn)中，比較于其他類型的SCFAs，異丁酸含量上的組間差異性最大；LCP組與空白組相比出現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01)，與對(duì)照組相比出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)；對(duì)照組與空白組相比，雖略微有所升高，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示兩組間并無顯著差異。丁酸可增加腸上皮細(xì)胞之間緊密連接蛋白的表達(dá)量，使得腸上皮細(xì)胞間緊密連接作用加強(qiáng)，抑制腸道通透性增加，增強(qiáng)黏膜屏障功能[14]；丁酸亦可促進(jìn)黏蛋白分泌，增加腸道潤滑度[15]。同時(shí)腸炎患者在口服丁酸腸溶片后，大部分患者腸炎病癥在臨床上得到緩解，內(nèi)鏡及組織病理實(shí)驗(yàn)顯示，典型促炎因子IL-1水平下降，在病理和生理上均未發(fā)現(xiàn)其他不良反應(yīng)[16]。研究發(fā)現(xiàn)LCP組丁酸含量與空白組、對(duì)照組相比，均出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，而對(duì)照組與空白組相比無顯著差異。

2.3 LCP對(duì)SHR腸道菌群的影響

研究首先在門水平上從厚壁菌門與擬桿菌門比值(F/B值)出發(fā)對(duì)腸道菌群進(jìn)行評(píng)估(圖2)，發(fā)現(xiàn)相比較于空白組和對(duì)照組，LCP組厚壁菌門明顯減少，擬桿菌門明顯增多，F(xiàn)/B值下降，與宏觀表現(xiàn)出的血壓下降結(jié)果一致。LCP組相較于空白組，厚壁菌門數(shù)量減少8.3%，擬桿菌門數(shù)量增加8.4%，空白組的F/B值是LCP組的1.53倍(表2)。對(duì)于降壓藥物卡托普利來說，門水平上的菌群結(jié)果并未顯示出其在調(diào)節(jié)腸道菌群上的差異性。

圖2 各組腸道內(nèi)門水平的菌群分布Fig.2 Intestinal flora distribution in level of Phylum

表2 門水平腸道菌群的F/B值

此外，本實(shí)驗(yàn)從屬水平對(duì)各組菌群的豐度(圖3)進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)LCP組在腸道主要優(yōu)勢菌群的豐度上明顯高于空白組和對(duì)照組。圖3中藍(lán)色為其他菌屬，綠色為毛螺菌科中未經(jīng)正式分類的未知屬，紅色為普雷沃克氏菌屬(Prevotella)。Dae-Wook等[17]在對(duì)比了神經(jīng)典型兒童與伴隨高比例胃腸道疾病的自閉型兒童的腸道菌群后發(fā)現(xiàn)后者的特征在于Prevotella水平的顯著降低，這表明Prevotella作為腸道有益菌和優(yōu)勢菌對(duì)于腸道調(diào)節(jié)的重要性。根據(jù)圖3、圖4的差異菌分析可知，LCP組中的Prevotella菌屬相較于空白組明顯占據(jù)優(yōu)勢。紫色為毛螺菌屬，是屬于梭菌的一類產(chǎn)丁酸菌，這一菌屬可通過產(chǎn)丁酸來預(yù)防人類的結(jié)腸癌[18]。

LEfSe分析可顯示不同組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)識(shí)，即找出兩組之間的差異菌株。分析水平選擇屬水平，在差異菌種的分析中發(fā)現(xiàn)，與空白組對(duì)比，LCP組的差異菌為普雷沃克氏菌屬(Prevotella)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)(圖4)。正常成人腸道細(xì)菌種類以擬桿菌型(Bacteroides)、普氏菌型(Prevotella)和瘤胃球菌型(Ruminococcus)3個(gè)屬的細(xì)菌為腸內(nèi)優(yōu)勢菌群[19]，可見LCP對(duì)調(diào)節(jié)腸內(nèi)菌群回歸正常水平有一定作用。普雷沃克氏菌屬消化纖維素，主要產(chǎn)生乙酸、丁酸以及少量的異丁酸。由于異丁酸可有效地促進(jìn)白色瘤胃球菌的生長[20]，故推測LCP組大鼠腸道菌群內(nèi)的普雷沃克氏菌的增多，有效地提高了腸道內(nèi)異丁酸的含量，進(jìn)而促進(jìn)瘤胃球菌屬的生長；而瘤胃球菌屬是典型的產(chǎn)丁酸菌[21]，所以腸道內(nèi)丁酸的含量也獲得了顯著地提高。

2.4 高血壓與腸道菌群的相關(guān)性分析

圖3 屬水平的腸道菌群豐度及普雷沃可氏菌比例Fig.3 Abundance of intestinal flora in level of genus and percentage of Prevotella

LDA分值為以10為底的對(duì)數(shù)值；LDA分值越大，代表物種豐度對(duì)差異效果影響越大。圖4 空白組和LCP組的差異菌分析Fig.4 Different bacteria of blank and LCP group

紅色表示正相關(guān)，藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)。*0.01

以收縮壓(SBP)的數(shù)據(jù)表征高血壓，通過環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析，借助大數(shù)據(jù)分析將高血壓與腸道菌群進(jìn)行關(guān)聯(lián)，結(jié)果如圖5。高血壓與Christensenellaceae_R_7_group、Lachnospiraceae_NK4B4_group、Marvinbryantia、Parabacteroides、unclassified_f_Lachnospiraceae5種細(xì)菌呈正相關(guān)，與Ruminiclostridium、Ruminococcus_1呈負(fù)相關(guān)。研究表明Christensenellaceae_R_7_group與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[22]，Marvinbryantia在神經(jīng)元活動(dòng)引起的腸道綜合征中豐度有所上升[23]，而Parabacteroides在高血壓個(gè)體的腸道中分布廣泛[24]，Lachnospiraceae_NK4B4_group和unclassified_f_Lachnospiraceae未查閱到與高血壓以及腸道生理功能相關(guān)的研究。Ruminococcus_1是瘤胃球菌的一種，主要產(chǎn)生丁酸，而瘤胃球菌與高血壓的負(fù)相關(guān)性也多有報(bào)道[21,25]。這一分析結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)中LCP組血壓的降低與產(chǎn)丁酸的瘤胃球菌有一定關(guān)系。

此外，表3是不同細(xì)菌在不同實(shí)驗(yàn)組中的豐度百分比。在與血壓正相關(guān)菌群中，LCP組的豐度皆低于空白組；而在負(fù)相關(guān)菌群中，LCP組的豐度略高于空白組。其中，擬桿菌與收縮壓呈負(fù)相關(guān)，但是與乙酸的產(chǎn)生呈正相關(guān)，這一分析結(jié)果與前面LCP組中擬桿菌門的豐度高于空白組一致。此外，LCP組中乙酸的含量顯著高于空白組，由此可以推測，乙酸含量的提高與擬桿菌門豐度提高可能有關(guān)。

3 結(jié) 論

Holmes等[26]在以亞洲黃種人和歐洲白種人為調(diào)查對(duì)象的研究中發(fā)現(xiàn)，SCFAs的水平和血壓具有很顯著的相關(guān)性。SCFAs在一定范圍內(nèi)可以激活孤兒型G蛋白偶聯(lián)受體(Gpr41)起到降壓作用。此外，SCFAs還可以通過直接地調(diào)節(jié)血管舒張程度進(jìn)而降低血壓[27]。在對(duì)SHR的腸道中SCFAs含量和菌種豐度的研究中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組WKY大鼠相比較，SHR結(jié)腸糞便中的丙酸和丁酸含量顯著減少[28]。體外實(shí)驗(yàn)證明乙酸可抑制細(xì)菌LPS誘導(dǎo)的炎癥因子釋放[29]；在給無菌小鼠通過口服方式給予濃度為150 mmoL/L乙酸后，其腸道炎癥因子含量下降，對(duì)腸道進(jìn)行組織活檢發(fā)現(xiàn)腸炎癥狀減輕，腸道內(nèi)環(huán)境得到改善[30]。

表3 各組中不同細(xì)菌的比例 Tab.3 Percentage of different bacteria in each group %

而厚壁菌門與擬桿菌門的比值與高血壓息息相關(guān)，眾多研究表明在高血壓患者或動(dòng)物模型中F/B值會(huì)增加。Yang等[28]在對(duì)高血壓大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，與血壓正常的WKY大鼠相比較，腸道菌群豐度、均勻度和多樣性等在SHR與Ang II誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型中顯著降低，同時(shí)F/B值增加，是正常WKY大鼠的5倍，產(chǎn)乙酸和產(chǎn)丁酸的細(xì)菌數(shù)量顯著減少。

本文研究結(jié)果基本符合前人的正向研究結(jié)論，LCP通過增加普雷沃克氏菌屬和瘤胃球菌屬的豐度來提高腸道內(nèi)SCFAs的含量，增加優(yōu)勢有益菌群的數(shù)量，降低腸道其他有害菌的占比，進(jìn)而改善腸道內(nèi)環(huán)境，即LCP能調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境以及使腸道菌群趨于正?；蚨哂袧撛诘母纳聘哐獕喊Y狀的作用。