徐銘陽(yáng) 盧家森 耿翔 劉卜郡 何健 黃星

摘要：以長(zhǎng)期受多菌靈和啶蟲(chóng)脒農(nóng)藥污染的土壤中分離篩選得到的多菌靈降解菌株慶笙紅球菌（Rhodococcus qingshengii sp. nov. ）djl-6和啶蟲(chóng)脒降解菌株噬染料菌（Pigmentiphaga sp. ）D-2為供試菌株，研究了降解菌菌劑的不同保存劑型與初步應(yīng)用的情況。結(jié)果表明，2株降解菌均以苯甲酸鈉作為防腐劑的處理效果最好，能維持活菌數(shù)較高且不產(chǎn)生雜菌污染。降解菌djl-6復(fù)配保護(hù)劑的最佳使用濃度：0.30%檸檬酸鈉、0.30%羧甲基纖維素、0.20% CaCl2。降解菌D-2復(fù)配保護(hù)劑的最佳使用濃度：0.20%糊精、0.20%檸檬酸鈉、0.30% CaCl2。與對(duì)照相比，添加保護(hù)劑后，菌株djl-6、菌株D-2活菌數(shù)分別夠提高32.03%、38.70%。2株菌的液體菌劑保存45 d后，降解菌djl-6能夠在10 d內(nèi)將土壤5 mg/kg多菌靈降解95.23%，降解菌D-2能夠在10 d內(nèi)將土壤5 mg/kg啶蟲(chóng)脒降解92.75%，有效延長(zhǎng)了液體菌劑的保存期。

關(guān)鍵詞：多菌靈降解菌;啶蟲(chóng)脒降解菌;液體菌劑;保存條件

中圖分類號(hào)： X172 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）17-0270-06

設(shè)施農(nóng)業(yè)作為農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展的重要產(chǎn)業(yè)越來(lái)越受到各國(guó)政府的重視，設(shè)施農(nóng)業(yè)不僅有效解決了我國(guó)淡季期間蔬菜短缺問(wèn)題，還促進(jìn)了居民傳統(tǒng)消費(fèi)結(jié)構(gòu)的改變[1]。但是設(shè)施農(nóng)業(yè)中蔬菜病蟲(chóng)害較多，農(nóng)藥的使用率也相對(duì)較高，以多菌靈和啶蟲(chóng)脒為代表的農(nóng)藥因其高效低毒的特點(diǎn)[2-4]而被廣泛應(yīng)用于設(shè)施農(nóng)業(yè)之中。多菌靈是一種內(nèi)吸性的廣譜殺菌劑，土壤中殘留的多菌靈會(huì)導(dǎo)致土壤微生物數(shù)量下降，抑制土壤脫氫酶、磷酸酶活性[5-6]。啶蟲(chóng)脒是一種內(nèi)吸殺蟲(chóng)劑，殘留在土壤中會(huì)抑制土壤固氮菌、放線菌活性，對(duì)土壤動(dòng)物產(chǎn)生慢性毒性[7-8]。

應(yīng)用微生物修復(fù)農(nóng)藥殘留污染是一種公認(rèn)的安全有效的方法。目前，我國(guó)農(nóng)藥殘留相關(guān)研究主要集中在高效降解菌株的篩選和培育上，在微生物菌劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面的研究仍然不夠完善[9-11]。微生物作為一種活體生物，其保存情況極易受到外界環(huán)境的影響，微生物液體菌劑的儲(chǔ)存一直是阻礙降解菌菌劑的大規(guī)模應(yīng)用的難題，而目前關(guān)于微生物液體菌劑保存條件的研究非常少[12-14]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離并保藏了多菌靈、啶蟲(chóng)脒降解菌株，其中多菌靈降解菌株能在7 d內(nèi)將5 mg/kg多菌靈降解80.0%，啶蟲(chóng)脒降解菌株在5 d內(nèi)將 10 mg/kg 啶蟲(chóng)脒降解90.0%。由于液體菌劑中的微生物易受周圍環(huán)境影響從而導(dǎo)致菌劑保存期短，本研究首先篩選出了2個(gè)菌株的液體菌劑防腐劑及其使用濃度，研究了菌劑不同保藏條件對(duì)其活菌數(shù)以及降解率的影響，以期為農(nóng)藥降解菌菌劑的保存與應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

多菌靈原藥購(gòu)自江蘇省新沂農(nóng)藥有限公司（純度99.8%）。啶蟲(chóng)脒原藥購(gòu)自綠源制藥集團(tuán)（純度98.3%）。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：硝酸銨1.0 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，氯化鈉1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH值7.0。

LB培養(yǎng)基：酵母浸出物5.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，超純水1 L，pH值7.0，固體培養(yǎng)基加入1.5%～2.0%的瓊脂。

D-2發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖9 g/L，硫酸銨 0.9 g/L，酵母膏0.3 g/L，氯化鈉0.1 g/L，碳酸鈣 1 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH值7.0～7.2。

djl-6發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖8 g/L，硫酸銨 0.8 g/L，酵母膏0.2 g/L，氯化鈉0.1 g/L，碳酸鈣0.5 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH值7.0～7.2。

1.2 供試菌株、供試作物與土壤

多菌靈降解菌株慶笙紅球菌（Rhodococcus qingshengii sp. nov. ）djl-6，啶蟲(chóng)脒降解菌株噬染料菌（Pigmentiphaga sp. ）D-2，均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離并保藏。

供試青菜品種為上海青，購(gòu)自南陽(yáng)青青種業(yè)。

供試土壤為黃棕壤，采集于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓試驗(yàn)基地。

1.3 液體菌劑防腐劑的篩選

1.3.1 防腐劑的初篩 設(shè)置菌株djl-6、菌株D-2這2組處理，每組處理取12個(gè)已滅菌的500 mL三角瓶（共24個(gè)）。每種菌設(shè)置4個(gè)防腐劑添加處理，依次為丙酸鈣、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、不添加試劑（CK），每個(gè)處理3個(gè)平行，共12個(gè)。每個(gè)處理依次加入相應(yīng)的已發(fā)酵的菌株發(fā)酵液300 mL和添加量為發(fā)酵液的0.50%（1.5 mL）的防腐劑，CK為不添加防腐劑的對(duì)照組，添加等體積（1.5 mL）的無(wú)菌水。用封口膜封緊，置于常溫條件下避光保存。放置3 d后，取樣，采用稀釋涂布平板法對(duì)菌株djl-6、菌株D-2以及雜菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算雜菌率[15-16]。

1.3.2 防腐劑的復(fù)篩 根據(jù)防腐劑的初篩結(jié)果，分別向菌株djl-6和菌株D-2發(fā)酵液中添加苯甲酸鈉作為防腐劑，添加量分別為發(fā)酵液的0.10%、0.30%、0.50%、0.70%、1.00%，同時(shí)設(shè)置不添加苯甲酸鈉的對(duì)照，后續(xù)操作同“1.3.1”節(jié)。

1.4 液體菌劑保護(hù)劑的篩選

1.4.1 單因子保護(hù)劑的篩選 分別挑取菌株djl-6、菌株D-2的單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，放置于30 ℃搖床中160 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以1%接種量接入到盛有500 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在無(wú)菌條件下裝入已高溫滅菌的50 mL無(wú)菌管中，再分別加入預(yù)先初篩過(guò)的氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、糊精、黃腐酸、羧甲基纖維素、甲酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉試劑作為助劑，使試管中的助劑添加量分別為0.10%和0.20%，同時(shí)設(shè)置不加助劑的對(duì)照，并向?qū)φ占尤胂嗤w積的無(wú)菌水，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。30 d 后取樣，通過(guò)稀釋涂布平板法計(jì)算有效活菌數(shù)。

2.4 液體菌劑對(duì)土壤中農(nóng)藥殘留的降解效果

按照“2.2.2”節(jié)中保護(hù)劑的配比分別將保護(hù)劑加入到djl-6、D-2的液體菌劑中保存45 d后，取 10 mL 菌劑各自加入到干土中含量為5 mg/kg多菌靈及啶蟲(chóng)脒干土的塑料杯中，10 d后測(cè)定土壤中農(nóng)藥的殘留量，并計(jì)算降解率。如圖3、圖4所示，djl-6 液體菌劑對(duì)土壤中農(nóng)藥殘留降解率最高的組合為正交組合9，10 d內(nèi)降解率達(dá)95.23%;其他組合的降解率與CK（不加任何保護(hù)劑）相比也有明顯提高，而在相同條件下CK降解率只能達(dá)到48.82%。D-2液體菌劑對(duì)土壤中農(nóng)藥殘留降解率最高的組合為正交組合5，10 d內(nèi)其降解率達(dá)到了92.75%，其他組合的降解率與CK（不加任何保護(hù)劑）相比也有明顯提高，而CK在相同條件下降解率只能達(dá)到41.21%。

3 討論與結(jié)論

微生物液體菌劑因工藝簡(jiǎn)單、制作成本低被廣泛使用，但由于微生物極易受到周圍環(huán)境的影響，在運(yùn)輸、保存、使用過(guò)程中菌劑的活性會(huì)發(fā)生變化[17-19]，如何提高菌劑的活性以及有效菌存活率成為活菌制劑亟需解決的難題。研究表明，向菌劑中添加保護(hù)劑以及抑制劑可以提高菌劑的活性，降低菌劑產(chǎn)品的污染率[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，加入防腐劑苯甲酸鈉后，與對(duì)照組相比雜菌率大大降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)苯甲酸鈉的添加量達(dá)到一定值后，不會(huì)出現(xiàn)雜菌污染，這與車建美等的研究結(jié)果[21]一致。這說(shuō)明防腐劑的加入有效地抑制了雜菌的生成，使多菌靈、啶蟲(chóng)脒降解菌株更好發(fā)揮功能。李劍峰等選擇了青霉素作為保護(hù)劑加入到解磷菌劑中使得目標(biāo)菌的增值速度變慢，提升了菌種的活力[22]。本研究通過(guò)正交試驗(yàn)研究出了保護(hù)劑的最佳組合，加入保護(hù)劑后，多菌靈、啶蟲(chóng)脒降解菌株的活菌數(shù)增加，液體菌劑保存30 d仍具有明顯的降解效果，這表明保護(hù)劑的加入延長(zhǎng)了菌劑的使用期。本研究均在盆缽中進(jìn)行，下一步農(nóng)藥殘留污染土壤的修復(fù)工作將在田間進(jìn)行，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)菌株djl-6和菌株D-2在試驗(yàn)田中定殖的生物量和對(duì)農(nóng)藥的降解。

本研究表明，通過(guò)添加苯甲酸鈉、丙酸鈣、山梨酸鉀3種具有抑菌防霉作用的防腐劑，分別對(duì)菌株djl-6和菌株D-2的雜菌率進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)2株降解菌均以苯甲酸鈉作為防腐劑效果最好。通過(guò)液體菌劑保護(hù)劑的正交篩選，降解菌djl-6復(fù)配保護(hù)劑的最佳添加量為0.10%的檸檬酸鈉、0.30%的羧甲基纖維素、0.20%的CaCl2。降解菌D-2復(fù)配保護(hù)劑的最佳添加量為0.10%的糊精、0.20%的檸檬酸鈉、0.30%的CaCl2。通過(guò)正交試驗(yàn)篩選的菌劑助劑能夠有效提高細(xì)菌存活率，其中djl-6的發(fā)酵液中活菌數(shù)能夠提高32.03%，D-2的發(fā)酵液中的活菌數(shù)能提高38.70%。添加有保護(hù)劑保存30 d的菌株djl-6的液體菌劑在3 d內(nèi)最多能夠降解93.65%的50 mg/L多菌靈，添加有保護(hù)劑保存30 d的菌株D-2的液體菌劑在3 d內(nèi)最多能夠降解85.32%的50 mg/L啶蟲(chóng)脒。添加有保護(hù)劑的保存45 d的菌株djl-6的液體菌劑，在10 d內(nèi)能將干土中含量為5 mg/kg的多菌靈降解95.23%。添加有保護(hù)劑的保存45 d的菌株D-2的液體菌劑，在 10 d 內(nèi)能將干土中含量為5 mg/kg的啶蟲(chóng)脒降解92.75%。本研究為農(nóng)藥降解菌菌劑的生產(chǎn)應(yīng)用及保存提供理論基礎(chǔ)。

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